Rett綜合征致病基因突變與臨床表型的研究

楊 李 王寶田 唐久來 吳 德

Rett綜合征是一種主要累及女性患兒，嚴重影響運動及智力發育的遺傳性罕見病，女童患病率為1/15 000～1/10 000，男性患兒更為罕見，約95%的患兒由位于X染色體長臂上的甲基CpG結合蛋白2(methyl CpG binding protein 2，MECP2)基因突變所導致，其他如細胞周期蛋白依賴激酶5(cyclin-dependent kinase like 5，CDKL5)、叉頭盒蛋白G1(forkhead box protein G1，FOXG1)等基因突變也可導致本病的發生[1]。典型Rett綜合征經過早期的正常發育至6～18個月齡后，出現已獲得技能的迅速退化、典型手部運動、小頭畸形、自閉癥、共濟失調以及呼吸節律紊亂等；除了典型Rett綜合征外，還有非典型的變異型，如先天性變異型、恢復部分言語能力的語言保留型及早發癲癇型[1-2]。本研究總結Rett綜合征臨床表現、分析突變基因，擴展臨床表型，提高對本病的早期診斷。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2017年1月至2019年12月在安徽醫科大學第一附屬醫院兒科就診，明確診斷為Rett綜合征的患兒，收集臨床資料，病例采集前患兒監護人均已簽署知情同意書。

病例1：女性，診斷年齡3歲7個月，系第1胎第1產，患兒1歲余可獨走，但僅能無意識發“ba、ma”音，曾以“孤獨癥”外院治療，約2歲半時出現顯著倒退，表現為獨走不穩，出現雙手反復交替用手指觸碰舌頭后放下的手部刻板動作，不再主動抓物，僅會發“a”音，不與人交流。3歲6個月出現癲癇，全面性強直發作，現接受抗癲癇藥物與生酮飲食治療。父母表型正常，否認家族史。

病例2：女性，診斷年齡1歲3個月，系第2胎第2產， 6～13個月期間身高增長緩慢，僅2 cm，現不會爬行，可扶站，無意識發“ba、ma”音，手部精細動作差，伴有刻板動作搓手、磨牙，頭圍43 cm，睡眠質量較差、節律紊亂，易激惹。患兒姐姐2歲8個月表型正常，父母表型正常，否認家族史。

病例3：女性，診斷年齡2歲，系第1胎第1產，6月齡前發育基本正常，1歲2個月時家長發現患兒只會無意識發“yi、ya”音，雙手出現無法穩定抓握，1歲5個月出現手部刻板動作，喜搓手、用手拍頭，與人交流欠佳，現患兒2歲，偶喜尖叫，與人無眼神交流，多動，手部刻板動作無改善，獨走欠穩。父母表型正常，否認家族史。

病例4：女性，診斷年齡4歲，系第2胎第1產，發育里程碑稍落后，2歲余可獨走，但姿勢異常，可有意識發“ye、ma”音，其后逐漸出現運動認知倒退，手拍口唇、搓手等刻板動作，眼神呆滯，情緒易激動，4歲時癲癇頻發，為全面性強直陣攣發作和復雜部分性發作。我院檢查示：高磷血癥、腎源性血尿；現接受抗癲癇藥物及生酮飲食治療。父母表型正常，否認家族史。

病例5：男性，診斷年齡3歲1個月，系第1胎第1產，10月齡獨坐不穩，無意識發“ba、ma”音，伴有通貫手，曾間斷隨訪于我科，1歲7個月獲獨坐能力，3歲1個月時已無法獨坐，不會發“ba、ma”音，四肢肌力、肌張力低下，出現脊柱側彎，睡眠節律紊亂，喜磨牙。患兒母親智力低下，無法生活自理，父親邊緣智力，基本生活與體力勞動無障礙。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集患兒及父母全血2 mL，提取DNA并質檢，合格后進入分析步驟。

1.2.2 測序與生物信息學分析 構建全外顯子文庫，通過illumina公司NovaSeq 6000系列測序儀進行高通量測序(PE150)，測序覆蓋度不低于99%。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)等軟件篩選及過濾，獲得可靠高質量突變數據。對檢測到的突變數據進行各大數據庫，如單核苷酸多態性數據庫(the Single Nucleotide Polymorphism Database，dbSNP)、千人基因組(1000 Genomes Project)、外顯子組整合數據庫(the exome aggregation consortium,ExAC)、外顯子測序計劃(Exome Sequencing Project,ESP)等頻率數據庫，在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)、人類基因突變數據庫(Human Gene Mutation Database,HGMD)、臨床相關的序列變異(Clinically Relevant Sequence Variations, ClinVar)等的關聯注釋。借助Provean、Polyphen2-HVAR、SIFT、Revel、M-Cap等蛋白結構預測軟件進行危害性分析，篩選可能影響蛋白結構的有害變異。

1.2.3 Sanger法一代測序驗證 根據需要驗證的位點進行引物設計，PCR技術擴增，對患兒及其父母樣本測序驗證。

1.2.4 危害性評級 根據注釋信息、頻率數據庫等依據美國遺傳學會(American College of Medical Genetics,ACMG)2015診斷指南，綜合評定危害等級為5級：致病、可能致病、良性、可能良性及意義未明。

2 結果

2.1 臨床特點 病例1～4均符合典型Rett綜合征的臨床診斷標準，病例5符合非典型Rett綜合征臨床診斷標準[2]，見表1。病例1除了典型Rett綜合征的表現外，同時伴發有癲癇；病例2頭圍43 cm，低于正常同齡兒童2個標準差；病例4伴有癲癇、堿性磷酸酶升高、高磷血癥、腎源性血尿；病例5為男性患兒，雖然該病例1歲2個月即明確存在致病突變，但至3歲后癥狀趨于明顯。

續表1

2.2 分子遺傳學檢測結果

病例1：檢測到一個位于X染色體的雜合基因突變 MECP2[c.808(exon4)C>T，p.Arg270Stop，217]，即第808號核苷酸由C突變為T，導致翻譯產物的第270號的精氨酸以后的217個氨基酸無法翻譯。Clinvar數據庫和HGMD數據庫中已確定相同的致病變異或者有相同的氨基酸改變。患兒父母上述位點均未檢測到變異，故屬新生變異，綜合評定危害等級：致病。Sanger測序驗證見圖1-A。

病例2：檢測到一個位于X染色體的雜合基因突變MECP2[c.763(exon4)C>T，p.Arg255Stop，232]，即第763號核苷酸由C突變為T，導致翻譯產物的第255號的精氨酸以后的232個氨基酸無法翻譯。Clinvar數據庫和HGMD數據庫中已確定相同的致病變異或者有相同的氨基酸改變。患兒父母上述位點均未檢測到變異，故屬新生變異，綜合評定危害等級：致病。Sanger測序驗證見圖1-B。

病例3：檢測到一個位于X染色體的雜合基因突變MECP2[c.799(exon3)C>T，p.Arg267Stop，220]，即第763號核苷酸由C突變為T，導致翻譯產物第267號的精氨酸以后的220個氨基酸無法翻譯。Clinvar數據庫和HGMD數據庫中已確定相同的致病變異或者有相同的氨基酸改變，PubMed查詢到該變異致病性的文獻報道。患兒父母上述位點均未檢測到變異，故屬新生變異，綜合評定危害等級：致病。Sanger測序驗證見圖1-C。

病例4：檢測到一個位于X染色體的雜合基因突變MECP2[c.916(exon4)C>T，p.Arg306Cys]，即第916號核苷酸由C突變為T，導致翻譯產物第306號氨基酸的精氨酸翻譯成半胱氨酸。Clinvar數據庫和HGMD數據庫中已確定相同的致病變異或者有相同的氨基酸改變。患兒父母上述位點均未檢測到變異，故屬新生變異，綜合評定危害等級：致病。Sanger測序驗證見圖1-D。

圖1 突變Sanger測序驗證結果

病例5：檢測到一個位于X染色體的半合子基因突變MECP2[c.1148(exon4)_c.1198(exon4)del，insC，p.Leu383Profs*5]從編碼序列1 148位置到1 198位置缺失50個堿基，導致其翻譯產物從第383位異亮氨酸開始，再翻譯5個氨基酸后終止；經蛋白結構預測軟件(Provean、Polyphen2-HVAR、Polyphen2-HDIV、M-Cap、Revel、Mutationtaster)2種以上統計方法預測該變異對基因及產物有影響。在正常人數據庫(dbSNP、千人南方、千人基因、ExAC等)中未見收錄，OMIM、HGMD、Clinvar數據庫中未發現疾病相關性報道。患兒父親為野生型，母親為雜合，故該患兒致病突變來源于其母親，綜合評定危害等級：致病。Sanger測序驗證見圖2。

圖2 突變Sanger測序驗證結果

3 討論

Rett綜合征是一種以運動、語言發育退化，以及典型的手部刻板動作等為特征的遺傳性疾病，上世紀60年代奧地利醫生Rett首次報道[3]。Rett綜合征患兒早期生長發育史大致正常，但隨后出現非連續性的病程進展，包括：停滯期、快速退化期、平臺期及后期運動退化期4個階段。在快速退化期，患兒會部分或者全部喪失有目的的手部功能和語言能力，同時出現運動障礙、呼吸異常，自閉特征逐漸顯現，以及癲癇發作等[2,4]。

Rett綜合征公認并且最新的診斷標準是(國際)Rett研究聯盟(Rett Search Consortium)于2002年診斷標準基礎上2010年再行修訂的版本，標準中指出：臨床診斷典型Rett綜合征需滿足全部的主要標準和排除標準，雖然支持標準在典型Rett綜合征中較為常見，但不是診斷的必要條件；而非典型Rett的診斷確立需至少滿足2條主要標準，且同時達到5條支持標準。由于標準中所羅列的臨床特征多具有年齡依賴性，即臨床表現到一定年齡階段才會顯現出來[2]，低年齡兒童的診斷的難度要大于年長兒。因此，在實際臨床工作中基因學檢測有助早期診斷，本研究病例2、病例5是基于基因學的早期診斷，其中病例5早期診斷 “可能非典型Rett綜合征”，后期隨訪中其臨床癥狀趨于明顯，診斷為“不典型Rett綜合征”。

癲癇雖未列于診斷標準中，卻是Rett綜合征常見的臨床表型。60%～80%的Rett綜合征患兒合并癲癇，在非典型Rett綜合征和嚴重表型的Rett綜合征患兒中發病率更高，常見的發作類型為復雜部分性以及全面性強直發作[5]。本研究中，病例1為全面性強直發作，病例4為復雜部分性以及全面性強直-陣攣發作。需要指出的是，Rett綜合征的呼吸節律紊亂可導致呼吸暫停、發紺、凝視，以及肌張力障礙等類似癲癇癥狀。本研究病例4同時伴有堿性磷酸酶升高、高磷血癥、腎源性血尿，但該患兒未見有其他未明意義突變關聯表型，且既往文獻中未見描述，本研究為首次報道該表型。

Rett綜合征絕大多數是由位于X染色體長臂上MECP2基因突變所致，約5%的患兒攜帶突變基因CDLK5、FOXG1或癲癇或智力障礙相關的突變基因。本研究中病例均為MECP2基因突變所致，其中病例1、2、3、4在Clinvar數據庫和HGMD數據庫中已確定相同的致病變異，或者有同樣的氨基酸改變[6-7]；病例5為較為罕見的男性患兒，其突變遺傳于有表型母親，尚無相同突變的文獻報道。國內報道1例MECP2基因突變致Rett綜合征男童于18月齡時因“呼吸衰竭”死亡[8]。由于MECP2基因位于X染色體上，其突變被認為對發育中的男性胎兒及出生后男嬰是致命的，故Rett綜合征的男性數量較少，國內一項較大樣本Rett綜合征回顧性研究對象也均是女性患兒[7]。

MECP2編碼甲基-CPG結合蛋白2，為核蛋白的一種，在每個組織細胞中均有表達，在神經元中尤其豐富，主要負責翻譯后的修飾作用。MECP2作為一個轉錄調控因子特異性地與甲基化DNA結合，募集蛋白伴侶和調節復合物來修飾轉錄活性。MECP2有3個主要的功能域：甲基CpG結合域(methyl-CpG-binding domain，MBD)、轉錄抑制域(transcription repression domain,TRD)、C終端域( C-terminal domain,CTD)。本研究中，病例1、2、3、4突變位于TRD區域，可導致該區域蛋白結構的改變，影響與甲基化的 DNA結合，進而影響MECP2轉錄抑制功能；病例5的突變位于CTD區域，突變可所致的結構改變，影響介導染色質折疊能力(見圖3)，參考文獻[9]繪制。除了突變位點外，突變類型也是影響表型的重要因素，MECP2基因突變致所編碼蛋白氨基酸截短突變的臨床表型最為嚴重，而大多數的末端截短突變與錯義突變的臨床表型則較為溫和[9]。本研究中，3例患兒為氨基酸的截短突變，1例移碼突變，1例患兒為錯義突變，但是錯義突變病例4的表型仍較嚴重。由于Rett綜合征雜合女性患兒是正常和突變MECP2的嵌合體攜帶者，因此臨床表型的差異也與X染色體的差異性失活有關。同樣，修飾基因的突變也可能減輕或增強患者的臨床癥狀[10]，這可能是本例錯義突變患兒表型仍較嚴重的原因。

圖3 MECP2突變位點示意圖

綜上，Rett綜合征是一種累及多器官系統的遺傳性疾病，目前尚無特異性有效治療手段，一些藥物仍然處在臨床前研究階段[11]，需要個體化的綜合康復治療，其中生酮飲食對癥狀有改善作用，尤其是合并癲癇的Rett患兒[11-12]。結合其遺傳學病因，目前有2種治療研究思路，一種直接針對MECP2突變，對MECP2下游通路的靶點進行治療；另一個潛在途徑是基因療法，即將正常的MECP2導入細胞進行治療[4,9,13]。最近，一個靶向基因治療罕見遺傳性眼病Leber先天性黑矇在美國被批準應用，這可能也是未來治療Rett綜合征的重要方法[14]。