Cbx4和FRMD4A在胃癌中的表達關(guān)系及意義

景曉莉

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來飲食結(jié)構(gòu)的改變、工作壓力增大等原因，胃癌漸呈年輕化趨勢[1]。胃癌早期癥狀不顯著，易被錯誤認為胃炎、胃潰瘍等疾病，貽誤最佳治療時期[2]。當(dāng)前胃癌發(fā)生發(fā)展機制尚不完全明了，遠期預(yù)后往往不佳，因此尋求評估胃癌進展與預(yù)后的新指標(biāo)對胃癌的免疫治療具有重要臨床價值。近年來，細胞衰老作為根治惡性腫瘤的靶標(biāo)已受到廣泛關(guān)注，研究表明，Cbx4可通過抑制細胞衰老促進肝細胞癌進展[3]，但Cbx4在胃癌中筆者未見研究。FRMD4A包含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域，包含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域的蛋白與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]，然而FRMD4A在胃癌中研究較少。本研究通過觀察胃癌組織及其癌旁組織Cbx4、FRMD4A表達差異，探討Cbx4、FRMD4A與臨床病理關(guān)系及其預(yù)后的關(guān)系，以期為胃癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年8月至2016年4月于我院進行手術(shù)治療的85例胃癌患者胃癌組織標(biāo)本作為胃癌組，另選取距癌組織邊緣>5 cm的對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本為癌旁組織組。患者均經(jīng)病理證實為胃癌。其中男52例，女33例；年齡41～75歲，平均年齡(56.21±4.92)歲。收集臨床病理資料，包括腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織分化程度、浸潤深度等。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象對本研究知情同意且簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①胃癌患者均經(jīng)手術(shù)病理證實；②術(shù)前未進行化療、放療及激素治療者；③病灶無明顯壞死區(qū)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①自身免疫性疾病者；②具有明顯炎癥細胞浸潤癌旁組織；③合并其他惡性腫瘤者；④臨床資料不完整者。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantification PCR，qRT-PCR)檢測Cbx4、FRMD4A mRNA表達:采用qRT-PCR法檢測胃癌組織及癌旁組織中Cbx4、FRMD4A mRNA 相對表達量。應(yīng)用TRI試劑提取胃癌組織及其癌旁組織標(biāo)本RNA，通過Bio Rad逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR反應(yīng)體系共為50 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，內(nèi)參照上游引物下游引物各0.5 μl，dNTP 0.5 μl Taq酶1 μl，待測樣本cDNA 5 μl，ddH2O 32.5 μl。完成后將其放入熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)，引物通過生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min；(95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s)×40個循環(huán)。Cbx4、FRMD4A均以GAPDH為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt算法[7]計算Cbx4、FRMD4A mRNA相對表達量。試驗重復(fù)3次，取平均值。見表1。

表1 引物序列

1.3.2 免疫組化法檢測Cbx4、FRMD4A蛋白表達:嚴格按照試劑盒說明書進行操作，3,3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色液進行顯色反應(yīng)，采用蘇木素復(fù)染并將其在不同梯度乙醇中脫水，中性樹脂進行封片，置于顯微鏡下進行觀察。2位具有豐富臨床經(jīng)驗醫(yī)師做雙盲閱片，以細胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色為陽性反應(yīng)，在200倍光鏡下觀察結(jié)果并從每個切片中選取10個高倍視野中隨機挑選并對陽性染色細胞數(shù)量進行統(tǒng)計。利用IP評分進行結(jié)果判讀：①染色強度，細胞無染色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。②陽性細胞數(shù)，染色細胞數(shù)<10% 0分；染色細胞數(shù)10%～30% 1分；染色細胞數(shù) 31%～60% 2分；染色細胞數(shù)>60% 3分。兩項計分結(jié)果相乘，>2分為陽性，<2分為陰性。

1.3.3 隨訪：患者出院后通過電話、郵件及上門隨訪方法觀察生存情況，終止日期為2019年4月。

2 結(jié)果

2.1 Cbx4、FRMD4A mRNA表達情況 與癌旁組織相比，胃癌組織中Cbx4、FRMD4A mRNA表達均顯著升高(P<0.05)。見表2。

組別Cbx4/GAPDHFRMD4A/GAPDH癌旁組1.01±0.200.64±0.15胃癌組1.37±0.231.22±0.21t值10.88920.721P值<0.001<0.001

2.2 胃癌組織及癌旁組織中Cbx4、FRMD4A蛋白表達情況 鏡下觀察，Cbx4定位于細胞核與細胞漿中，呈棕黃色顆粒狀。FRMD4A陽性表達主要位于細胞漿中，呈棕黃色顆粒狀，胃癌組織中陽性表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)。與癌旁組相比，胃癌組Cbx4、FRMD4A蛋白陽性表達率均升高(P<0.05)。見表3，圖1。

2.3 Cbx4、FRMD4A蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 Cbx4、FRMD4A表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小差異均無關(guān)(P>0.05)；Cbx4蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度為T3～ T4、病理分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低患者中陽性表達率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度T1～ T2、病理分期Ⅰ～Ⅱ期、分化程度中高度患者(P<0.05)。FRMD4A蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度為T3～ T4、病理分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低患者中陽性表達率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度T1～ T2、病理分期Ⅰ～Ⅱ期、分化程度中高度患者(P<0.05)。見表4。

表3 2組Cbx4、FRMD4A蛋白表達情況 n=85

圖1 Cbx4、FRMD4A蛋白表達情況(SP×200);A 癌旁組織Cbx4蛋白陰性表達；B 胃癌組織Cbx4蛋白陽性表達；C 癌旁組織FRMD4A弱陽性表達；D 胃癌組織FRMD4A陽性表達

2.4 胃癌組織中Cbx4、FRMD4A表達與預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier法分析顯示，Cbx4陽性表達患者的總生存率顯著低于Cbx4陰性表達者(27.5% vs 76.5%，P<0.05)，F(xiàn)RMD4A陽性表達者的總生存率顯著低于FRMD4A陰性表達者(23.4% vs 76.3%，P<0.05)。見圖2。

2.5 胃癌預(yù)后危險因素分析 單因素COX分析顯示，性別、年齡、TNM分期、分化程度、腫瘤大小、浸潤深度、Cbx4、FRMD4A均是影響胃癌預(yù)后的危險因素(P<0.05)；多因素COX分析顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、浸潤深度T3～ T4、Cbx4陽性表達、FRMD4A陽性表達是影響胃癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素(HR=1.575，2.491，1.575，3.709，3.691，P<0.05)。見表5。

表4 Cbx4、FRMD4A表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國各種惡性腫瘤中胃癌發(fā)病率居首位，隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，患者趨于年輕化。Cbx4屬于PcG家族成員，有研究表明Cbx4在大腸癌、肝癌癌組織中高表達[5-7]，但在胃癌中則較少。FRMD4A是近年來被克隆鑒定的新基因，F(xiàn)RMD4A基因表達產(chǎn)物FRMD4A蛋白是一類擁有FRMD結(jié)構(gòu)域的蛋白，F(xiàn)RMD結(jié)構(gòu)域具有調(diào)控細胞骨架，參與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的功能[8]。FRMD4A在鱗狀細胞癌中高表達，但在胃癌中研究較少。

圖2 胃癌組織中Cbx4、FRMD4A表達與預(yù)后的關(guān)系；左為Cbx4表達與預(yù)后的關(guān)系；右為FRMD4A表達與預(yù)后的關(guān)系

表5 胃癌患者預(yù)后影響因素分析

細胞衰老是指細胞周期無法進入S期啟動染色質(zhì)復(fù)制完成增殖活動的過程，衰老細胞可被免疫細胞清除，是腫瘤發(fā)生過程中的天然屏障[9]。多梳家族蛋白(polycomb group，PcG)表達失調(diào)可造成多種惡性腫瘤，并可調(diào)節(jié)細胞衰老[10,11]。Cbx4基因是一個特殊的PcG蛋白，定位于17號染色體17q25.3，屬于PRC1復(fù)合物組分之一，而PRC1是PcG蛋白的主要成分之一[12]。Li等[13]研究表明，Cbx4可通過提高HIF-1α表達，增強低氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子表達，并促進血管生成，從而促進肝細胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Zeng等[14]研究表明，Cbx4可促進乳腺癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究中，胃癌組織中Cbx4 mRNA表達顯著高于其癌旁組織，免疫組化法結(jié)果顯示胃癌組Cbx4蛋白陽性表達率顯著高于癌旁組織組，提示Cbx4在胃癌組織中高表達，可能與胃癌的發(fā)生具有一定關(guān)系。進一步分析顯示，Cbx4蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、病理分期、分化程度等密切相關(guān)。另外，Cbx4陽性表達者3年內(nèi)總生存率顯著低于Cbx4陰性表達者，提示Cbx4陽性表達可能影響患者生存時間，不利于胃癌患者預(yù)后。進一步研究表明，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度T3～ T4、分化程度低、Cbx4陽性表達是患者預(yù)后不良的獨立危險因素，提示對于術(shù)后胃癌患者，檢測Cbx4蛋白表達水平結(jié)合TNM分期、浸潤深度、分化程度可能更準(zhǔn)確地評估患者預(yù)后，優(yōu)化治療方法。

FRMD4A基因位于人染色體10p13，編碼的FRMD4A蛋白屬于FERM超家族成員，擁有FERM結(jié)構(gòu)域，而含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15-17]。目前對FRMD4A研究較少，通常參考其他具有FERM結(jié)構(gòu)域蛋白的研究進行了解。Goldie等[18]研究表明，在人鱗狀細胞癌中FRMD4A高表達。本研究胃癌組織中FRMD4A mRNA表達顯著高于其癌旁組織，免疫組化試驗顯示FRMD4A蛋白在胃癌組織中陽性表達率高于癌旁組織，提示FRMD4A表達與胃癌發(fā)生密切相關(guān)。FRMD4A陽性表達率隨TNM分期、浸潤深度升高、病理分期升高、向低分化發(fā)展、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而升高，與性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)，提示FRMD4A表達與臨床病理特征密切相關(guān)。生存分析顯示，F(xiàn)RMD4A陽性表達者3年內(nèi)總生存率顯著低于FRMD4A陰性表達者，進一步研究表明，F(xiàn)RMD4A陽性表達亦是胃癌不良預(yù)后的獨立危險因素之一，提示檢測FRMD4A表達對胃癌預(yù)后評估具有一定參考價值。

綜上所述，胃癌組織中Cbx4、FRMD4A高表達，二者與胃癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，檢測Cbx4、FRMD4A表達對預(yù)后判斷等具有一定臨床意義。