沉默Paralemmin-3表達對缺氧復氧致心肌細胞損傷的保護作用

王月 黃冬梅 張永紅 雷鳳

急性心肌梗死是一種嚴重的缺血性心臟病，可導致心律失常、心力衰竭等多種預后不良的并發癥。患者一般具有冠狀動脈粥樣硬化的病理基礎，在激動、過勞、暴飲暴食、寒冷等因素的刺激下，可導致粥樣斑塊破裂、血栓形成或動脈痙攣，從而誘發心肌梗死的發生[1]。盡快實施經皮冠狀動脈介入術是治療急性心肌梗死的有效方法，但是快速的循環重建會不可避免的導致心肌細胞受到缺氧復氧損傷[2]。研究發現，缺氧復氧損傷的病理機制可能包括炎癥的級聯擴大、氧化應激失衡、脂質的過氧化、鈣離子的過載、心肌細胞的凋亡與自噬等[3]，但是部分病理過程的關鍵環節尚不明確，可能是目前治療研究結果并不理想的主要原因。Paralemmin-3(PALM3)是Paralemmin蛋白家族的成員之一，在1992年首次于非洲爪蛙中發現，可能作為中間分子參與調節Toll樣受體/白介素-1受體(Toll like receptor/Interleukin-1 receptor，TIR)信號通路[4,5]。Chen等[6-8]發現，PALM3可以與單免疫球蛋白白介素-1受體相關蛋白(single immunoglobulin IL-1 receptor-related molecule，SIGIRR)的羧基端相互結合，抑制SIGIRR的表達，而SIGIRR是TIR信號通路中關鍵的負性調控因子。抑制PALM3的表達可減輕脂多糖誘導的炎性反應，可能與上調SIGIRR表達，從而抑制TIR信號通路有關[9,10]。TIR信號通路也參與缺氧復氧損傷的炎癥級聯擴大[11,12]，但是PALM3在其中的作用尚不清楚。因此，本文探討PALM3在缺氧復氧致心肌細胞損傷中的表達變化，并且使用RNA干擾技術沉默PALM3表達，以研究其在缺氧復氧損傷中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 大鼠H9c2細胞購置于中科院上海細胞庫；胎牛血清、DMEM培養基、胰酶購置于美國Gibco公司；靶向序列與引物序列合成于上海生物工程有限公司；LipofectamineTM 2000購置于美國Invitrogen公司；BamHⅠ酶、HindⅢ酶、Trizol試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購置于日本Takara公司；pGenesil-1.1質粒購于武漢晶賽生物技術有限公司；蛋白質裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發光試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；PVDF膜購于美國Millipore公司；MTT、二甲基亞砜購于美國Sigma公司；一抗均購于英國Abcam公司；二抗均購于武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 H9c2細胞的培養 使用含10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養，放置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中。每2天換液一次，待細胞匯合度達到85%左右時，使用0.25 g/L的胰酶消化傳代，使用第3～4代的細胞進行后續實驗。

1.3 RNA干擾質粒的構建與轉染 根據Chen等[7]報道將5’-AGATCTTGATGGAGGGTTT-3’作為靶向序列，合成PALM3的干擾RNA(siRNA-PALM3)和對照序列(siRNA-Control)。將單鏈寡核苷酸片段退火成雙鏈，使用酶切、連接、轉化等基因工程的方法將其構建至pGenesil-1.1質粒的BamHⅠ酶切位點和HindⅢ酶切位點間。使用LipofectamineTM 2000將測序正確的siRNA-PALM3質粒和siRNA-Control質粒轉染至H9c2細胞。見表1。

表1 干擾RNA的序列

1.4 缺氧復氧損傷模型的構建 參照文獻[13]報道構建缺氧復氧損傷模型，具體步驟：待細胞融合至85%左右時，用無菌的PBS洗滌2～3次，盡可能地除去培養基。加入缺氧液，即經95% N2和5% CO2的混合氣體飽和30 min的DMEM培養基(無血清)，放入37℃培養箱中，持續通入95% N2和5% CO2的混合氣體，在該缺氧環境中培養4 h。然后更換為復氧液，即經95%空氣和5% CO2的混合氣體飽和30 min的DMEM培養基(含10%胎牛血清)，放于37℃培養箱中，在正常培養條件下培養4 h，以模擬復氧環境。

1.5 實驗分組 將H9c2細胞隨機分為4組，即對照組、模型組、siRNA-Control組、siRNA-PALM3組。對照組使用未進行缺氧復氧損傷的正常細胞；模型組使用進行缺氧復氧損傷的細胞；siRNA-Control組使用siRNA-Control質粒轉染的細胞，轉染48 h后進行缺氧復氧損傷；siRNA-PALM3組使用siRNA-PALM3質粒轉染的細胞，轉染48 h后進行缺氧復氧損傷。

1.6 蛋白質免疫印跡(Western blot，WB) 構建模型處理結束后，收集細胞，加入含PMSF的蛋白質裂解液，充分裂解后，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液進行BCA蛋白定量。按照聚丙烯酰胺凝膠試劑盒配制濃縮膠和分離膠，向樣品孔中加入30 μg的總蛋白，跑膠結束后，將目的蛋白電轉膜至PVDF膜。使用5%的牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入稀釋后的一抗在4℃孵育過夜，稀釋比例：抗PALM3抗體為1∶1 000、抗NF-κB抗體為1∶2 000、抗SIGIRR抗體為1∶1 000、抗GAPDH抗體為1∶5 000。洗滌3次后，加入二抗于37℃孵育1 h，二抗稀釋比例為1∶5 000，洗滌3次，使用ECL發光試劑盒顯色，凝膠成像儀曝光和拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測定各條帶的灰度值，目的蛋白的相對表達量=目的蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值，將對照組的目的蛋白相對表達量作為1，進行統計分析。

1.7 熒光定量聚合酶鏈式反應 處理結束后，收集細胞，Trizol法提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒獲得cDNA，使用熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒檢測PALM3的表達量。使用ABI 7 500型定量PCR儀進行反應，條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s、62℃ 45 s、72℃ 2 min，共進行35個循環；72℃ 10 min。將反應產物加入到瓊脂糖凝膠的樣品孔中，跑膠結束后，凝膠成像儀曝光和拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測定各條帶的灰度值，目的基因的相對表達量=目的基因的灰度值/GAPDH基因的灰度值，將對照組的目的基因相對表達量作為1，進行統計分析。見表2。

表2 引物序列

1.8 免疫熒光染色 處理結束后，用4℃預冷的丙酮固定細胞30 min，山羊血清封閉20 min，加入稀釋后的抗PALM3抗體4℃過夜孵育，稀釋比例為1∶100。次日，洗滌后加入FITC標記的二抗室溫孵育2 h，二抗稀釋比例為1∶200，洗滌后，用DAPI復染，熒光顯微鏡下觀察和拍照。每組隨機選取3個樣本，每個樣本隨機選取3個非重疊的視野(200×)進行拍照，使用Image Pro Plus 6.0軟件測定綠色熒光的光密度值，將對照組的光密度值作為1，進行統計分析。

1.9 MTT試驗 將對數生長期的H9c2細胞按照每孔5 000個細胞接種至96孔板，每組設置5個復孔，放于37℃培養箱中，在正常條件下培養至匯合度為85%左右，各組按照上述方法進行轉染和缺氧復氧損傷。處理結束后每孔加入20 μl的MTT溶液，繼續培養4 h，吸棄上清液，加入150 μl的二甲基亞砜，低速振蕩10 min，使用酶標儀于490 nm處測定各孔的吸光度值(OD)。計算細胞存活率=(試驗組的OD值-空白孔的OD值)/(對照組的OD值-空白孔的OD值)×100%。

1.10 酶聯免疫吸附試驗 處理結束后，收集細胞培養上清液，3 000 r/min離心10 min，留取上清液，按照酶聯免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，Elisa)試劑盒的說明書測定上清液中白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的含量。

2 結果

2.1 4組細胞中PALM3表達比較 與對照組相比較，模型組和siRNA-Control組細胞中PALM3 mRNA、蛋白質的表達量和相對熒光強度均升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組和siRNA-Control組相比較，siRNA-PALM3組細胞中PALM3 mRNA、蛋白質的表達量和相對熒光強度均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 細胞中PALM3表達的檢測；A：qRT-PCR檢測PALM3 mRNA的表達；B：WB檢測PALM3蛋白質的表達；C：免疫熒光染色檢測PALM3蛋白質的表達(200×)

組別mRNA蛋白質相對熒光強度對照組1.00±0.171.00±0.181.00±0.23模型組4.21±0.69?3.85±0.58?4.77±0.80?siRNA-Control組4.08±0.62?3.92±0.55?4.61±0.89?siRNA-PALM3組0.93±0.19#△1.04±0.20#△0.91±0.26#△ F值145.800153.900119.900 P值<0.001<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-Control組比較，△P<0.05

2.2 4組細胞間存活率及上清液中炎性因子含量比較 與對照組比較，模型組、siRNA-Control組和siRNA-PALM3組的細胞存活率均降低，上清液中IL-1β和TNF-α的含量均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組和siRNA-Control組比較，siRNA-PALM3組的細胞存活率升高，上清液中IL-1β和TNF-α的含量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

組別存活率(%)IL-1β(ng/L)TNF-α(ng/L)對照組100.00±9.3836.04±4.17326.59±29.04模型組43.26±7.50?95.22±10.83?571.80±70.66?siRNA-Control組41.89±8.66?93.27±9.50?582.14±73.02?siRNA-PALM3組78.32±10.51?#△53.11±7.94?#△414.65±62.49?#△ F值97.310121.10041.140 P值<0.001<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-Control組比較，△P<0.05

2.4 4組細胞中NF-κB表達比較 與對照組比較，模型組、siRNA-Control組和siRNA-PALM3組細胞中NF-κB蛋白質的表達量均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組和siRNA-Control組比較，siRNA-PALM3組細胞中NF-κB蛋白質的表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表5。

圖2 WB檢測NF-κB蛋白質的表達

組別NF-κBSIGIRR對照組1.00±0.191.00±0.24模型組3.88±0.36?0.42±0.17?siRNA-Control組3.95±0.39?0.47±0.20?siRNA-PALM3組1.92±0.24?#△0.77±0.23?#△ F值229.20016.450 P值<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-Control組比較，△P<0.05

2.5 4組細胞中SIGIRR表達比較 與對照組比較，模型組、siRNA-Control組和siRNA-PALM3組細胞中SIGIRR蛋白質的表達量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組和siRNA-Control組相比較，siRNA-PALM3組細胞中SIGIRR蛋白質的表達量升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

PALM3是TIR信號通路中新發現的一種接頭分子，具體的生物學作用尚不清楚，但是初步的研究顯示，可能類似于髓樣細胞分化蛋白88(Myeloid differential protein 88，MyD88)、白介素1受體相關激酶(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)等接頭分子，用于傳遞上游TLR的信號，并且激活下游NF-κB，從而參與調節炎癥反應[8,9]。Li等[9]使用脂多糖誘導以肺部炎癥為主要病理表現的急性肺損傷動物模型中，PALM3呈明顯的高表達，通過慢病毒介導的RNA干擾技術抑制PALM3的表達，可顯著降低支氣管肺泡灌洗液中炎性因子的含量以及中性粒細胞的比例，抑制毛細血管通透性的升高，提高小鼠的生存率，表明PALM3可能是炎癥調節中的關鍵分子。但是目前為止，關于PALM3的研究時間較短，除了脂多糖的致炎模型外，其表達及具體作用機制尚未在其他炎性疾病中得到證實。

圖3 WB檢測SIGIRR蛋白質的表達

炎癥的級聯擴大是缺氧復氧損傷的主要病理機制，而PALM3是否參與其中尚不清楚。因此，本文首先根據文獻[13]報道，模擬了缺氧和復氧的細胞培養環境，成功構建了缺氧復氧致心肌細胞損傷的模型，表現為細胞生存率的降低、上清液中IL-1β和TNF-α含量的升高、NF-κB的高表達。然后，分別使用qRT-PCR和WB從基因和蛋白質兩個方面，證實PALM3在在心肌細胞缺氧復氧損傷中呈高表達，而且免疫熒光染色結果顯示，PALM3主要分布于細胞質中。

本文參照Chen等[7]的報道，設計合成了RNA干擾序列，并成功構建至pGenesil-1.1質粒中，對缺氧復氧損傷的H9c2細胞進行轉染后發現，PALM3的mRNA和蛋白質的表達量均顯著降低，表明此干擾序列的沉默效果較好，與Chen等[7]使用慢病毒載體進行RNA干擾的報道相一致。質粒作為小干擾RNA載體雖然沉默效果可能不如慢病毒、腺病毒等載體，但是具有簡單、方便的優勢，而且本文的研究目的是初步探討PALM3的作用，僅使用體外細胞模型進行初步實驗，質粒作為載體已經能達到較好的沉默效果，但是在以后使用心臟缺血再灌注損傷動物模型時，可能需要構建病毒載體，以增強轉染效率和沉默效果。

為了研究PALM3的沉默是否對H9c2細胞缺氧復氧損傷具有保護作用，我們分別對細胞存活率、炎癥因子的釋放以及NF-κB的表達量進行了檢測，結果顯示與模型組和siRNA-Control組相比較，siRNA-PALM3組細胞的存活率升高，上清液中IL-1β和TNF-α的含量均降低，NF-κB蛋白質的表達量降低。缺氧復氧損傷導致細胞生存率降低的原因較多，其中高炎癥水平是主要原因之一，大量釋放的炎性因子可以激活細胞的凋亡信號通路，誘導死亡受體信號通路相關蛋白的表達與匯聚[14]，因此沉默PALM3使細胞生存率上調的原因可部分歸功于對NF-κB炎癥通路及炎性因子釋放的抑制作用。

為了進一步研究沉默PALM3對NF-κB介導炎癥的抑制機制，需要對NF-κB上游接頭分子的表達情況進行分析。在細胞受到缺氧復氧的外界刺激時，可激活TLR介導的免疫防御通路，通過活化MyD88、IRAK、TRAF6等接頭分子促進IκB(Inhibitor of kappa B)磷酸化，磷酸化的IκB與NF-κB解離，使NF-κB入核上調炎性因子的轉錄與表達[15]。有研究發現，SISIRR可與MyD88、IRAK、TRAF6等分子相互作用，從而在上述炎癥信號通路中發揮抑制作用[16]。我們對SISIRR進行檢測發現，沉默PALM3可以上調SIGIRR的表達，可能是NF-κB表達及炎性因子分泌受到抑制的主要原因。Chen等[8]使用免疫共沉淀等方法也證實了PALM3與SIGIRR間存在直接的相互作用，進一步支持了本文的結論。

本文的局限性：(1)研究發現，PALM3作為接頭分子還可以與TIR信號通路中其他分子發生相互作用，包括IRAK-1、TIACM-2、TRAF-6等[6]，但是本文未對這些分子的表達情況進行檢測；(2)本文僅使用了缺氧復氧的體外細胞模型，未構建心臟缺血后再灌注損傷動物模型，以進一步探討PALM3的表達變化，以及敲低PALM3是否具有保護作用。

綜上所述，在缺氧復氧損傷中，PALM3的表達顯著升高，使用RNA干擾沉默PALM3的表達，可以提高細胞的存活率，降低炎癥因子的分泌和NF-κB的表達，可能與促進SIGIRR的表達有關。