USP1調節心肌細胞肥大的效果研究

高偉年 張文立 郭娜 陳子英 趙曙光 于丁 閆芳 廖紅娟 崔紅占 孫涌泉

心臟必須不斷地泵血，為身體提供氧氣和營養，這一過程需要消耗大量的能量。因此，心臟具有多個復雜的生物系統，以適應系統需求的變化[1]。心肌肥厚是應對各種內在或外在刺激后的一種生理或病理狀態的心臟反應。心肌肥厚的發生是促肥大因子和抗肥大因子失衡的結果[2]。維持促肥大因子和抗肥大因子之間的平衡在治療心肌肥大方面具有很大潛力[3]。然而，心肌肥厚發生的機制尚不清楚。泛素特異性蛋白酶1(USP1)是去泛素化酶家族中的重要一員。USP1和USP1相關因子(UAF1)形成穩定復合物，促進USP1活性，USP1/UAF1復合物去泛素化FANCD2蛋白參與范可尼貧血通路的DNA損傷修復[4,5]，調節PCNA泛素化參與損傷合成[6]。并且USP1 在多種腫瘤中高表達，提示可能與腫瘤的發生發展有關[7-9]。但是，USP1在心肌肥厚中的作用尚不清楚，本研究旨在探討USP1在心肌肥厚中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級出生72 h的SD乳鼠20只，雌雄不限，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)-2016-0006]。10只SPF級的C57BL/6雄性小鼠，8～12周，22～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)-2016-0006]。無菌手術在實驗動物中心進行[SYXK(冀)2018-008]。實驗動物使用按照3R原則給與人道的關懷照顧。

1.2 主要試劑與儀器 主要試劑：異丙腎上腺素(批號：20061109)購自濟南科匯藥業有限公司；引物由Primer 5.0軟件設計，由華大基因公司合成；shRNA由北京唯創博精生物科技有限公司設計合成并包裝腺病毒；RIPA Lysis and Extraction Buffer(貨號：89900)、蛋白酶抑制劑(貨號：A32965)、TRIzol(貨號：15596018)和磷酸酶抑制劑(貨號：A32957)均購自Thermo公司；cDNA 逆轉錄試劑盒(貨號：KR106)和SuperReal熒光定量預混試劑(貨號：FP216-02)和極超敏ECL化學發光試劑盒(貨號：P0018FS)購自北京天根生物科技有限公司；USP1(貨號：ab108104)和GAPDH(貨號：ab181602)一抗均購自Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒(貨號：P0012)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(貨號：A0208)購自碧云天生物技術有限公司。主要儀器：實時定量PCR儀(Bio-Rad，美國)；高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)；冷凍冷藏兩用冰箱(海爾，中國)；-80℃超低溫冰箱(賽默飛，美國)；轉膜儀(六一，北京)；電泳儀(六一，北京)。

1.3 實驗方法

1.3.1 異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚小鼠模型的建立：將10只C57BL/6雄性小鼠隨機分為2組，每組5只。實驗組(ISO組)，將配置好的8.7 mg·kg-1·d-1濃度的ISO注入滲透壓微泵(model 2001;ALZET)，然后植入雄性小鼠的背部皮下。持續給藥7 d后評價心肌肥厚。而對照組同樣利用滲透泵持續給予0.9%氯化鈉溶液。本試驗由河北醫科大學第二醫院實驗動物倫理委員會批準，批準號為：2018-P047。

1.3.2 分離大鼠原代心肌細胞：取20只新生大鼠心臟，將心臟移入盛有D-Hanks液的平皿中，剪去心房，剪開心室；洗凈殘留積血，并將心室組織塊放入小三角瓶中，用眼科剪剪成1 mm小碎塊，以備消化；在裝有心室組織塊的小三角瓶中加入0.2%胰蛋白酶約8～10 ml，放入水浴式恒溫振蕩器中(37℃，速度100次/min)消化8～10 min；加入胰蛋白酶繼續反復消化，共8～10次消化，將多次消化所得上清混合；1 200 r/min室溫離心8～10 min；用10～15 ml含20%小牛血清的DMEM懸浮沉淀；將細胞懸液用300目網過濾置10 cm平皿中。1 h后更換培養板，分離先貼壁的成纖維細胞。以α-actinin鑒定心肌細胞純度。

1.3.3 ShRNA腺病毒感染：將USP1 干擾及其對照腺病毒，感染細胞。腺病毒感染48 h后進行后續的實驗操作。USP1 干擾序列為：5’-GCACAGTCCTCACCAGTAA-3’,對照干擾序列為：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

1.3.4 RT-qPCR反應檢測mRNA的表達水平：用TRIzol法提取細胞總RNA，逆轉錄酶合成cDNA，PCR擴增檢測目的基因mRNA的表達水平，GAPDH為內參基因，分別設三個復孔，計算mRNA的相對表達量。本研究中所用到的引物如下表。見表1。

表1 qRT-qPCR引物序列

1.3.5 Western Blot：細胞裂解前使用預冷的PBS清洗細胞兩次，提前配制加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液RIPA，加入適量細胞裂解液，冰上裂解20 min。裂解后于4℃，12 000 r/min離心15 min后收集上清。使用10% SDS-PAGE分離，之后將蛋白轉印于PVDF膜。轉膜完成后，使用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入一抗和二抗孵育后顯影。

1.3.6 細胞面積的統計：心肌細胞使用將α-actinin免疫熒光染色之后，將保存的圖像使用Image J軟件分析心肌細胞的面積。每孔隨機測量10個細胞的面積，取各個細胞的平均值。

2 結果

2.1 成功建立小鼠心肌肥厚模型 應用異丙腎上腺素(ISO)誘導的方法建立小鼠心肌肥厚模型，并檢測其心臟組織中心肌肥厚標志基因Anp、Bnp及Myh7基因的表達。熒光定量PCR結果顯示，與對照組相比，心肌肥厚小鼠心臟組織中Anp，Bnp及Myh7基因的mRNA水平顯著上調(P<0.05)，提示小鼠心肌肥厚模型建立成功。見表2。

組別qPCR相對表達量ANPBNPMYH7對照組1.00±0.031.00±0.051.00±0.08ISO組2.53±0.123.34±0.434.21±0.32t值21.429.3616.86P值<0.00010.0007<0.0001

2.2 USP1在心肌肥厚小鼠的心臟組織中表達水平顯著上調 檢測USP1在小鼠心肌肥厚過程中的表達水平，ISO誘導的心肌肥厚中，USP1的mRNA和蛋白表達水平均顯著上調(P<0.05)。鑒于在小鼠心肌肥厚過程中USP1的表達水平均上調，我們推測USP1可能參與了心肌肥厚的發生發展。見表3，圖1。

類別qPCR檢測USP1相對表達量Saline1.00±0.05ISO 2.93±0.62t值5.35P值0.0058

2.3 腺病毒介導的RNA干擾技術可有效敲低大鼠原代心肌細胞中USP1基因的表達 USP1基因的有效敲減是分析USP1基因功能的前提。為了進一步探討USP1基因的功能，我們首先檢測腺病毒介導的RNA干擾技術對USP1基因的干擾效率。我們應用熒光定量PCR和Western Blot技術檢測shUSP1在大鼠原代心肌細胞中的干擾效率。熒光定量PCR結果顯示，與對照病毒相比，shUSP1干擾病毒可以顯著下調大鼠原代心肌細胞中USP1基因的表達，抑制效率達到了81.3%(P<0.001)。并且，Western Blot結果顯示，shUSP1干擾腺病毒可以顯著下調大鼠原代心肌細胞中USP1基因的蛋白水平。見表4，圖2。

圖1 ISO誘導可以上調USP1蛋白的表達

組別qPCR檢測USP1相對表達量shCtrl 1.00±0.09ShUSP10.25±0.01t值14.35P值<0.0001

圖2 腺病毒介導RNA干擾技術可以有效的干擾新生乳大鼠心肌細胞的USP1基因蛋白的表達

2.4 干擾USP1的表達抑制ISO引起的心肌肥厚反應 在ISO刺激的原代心肌細胞中，干擾USP1的表達明顯減小細胞面積。另外，干擾USP1的表達也會抑制ISO對Anp和Bnp基因表達的促進作用。而在PBS組中，干擾USP1的表達對細胞大小以及Anp、Bnp及Myh7基因的表達并無顯著影響。這些結果表明干擾USP1的表達能夠顯著抑制ISO誘導的心肌肥厚反應。見表5～7。

類別心肌細胞面積(μm2)t值P值ISO-Ad-shCtrl4032±211ISO-Ad-shUSP1 2434±143?10.860.0004PBS-Ad-shCtrl 1843±132?15.230.0001PBS-Ad-shUSP11823±98

注：與ISO-Ad-shCtrl組比較，*P<0.05

類別ANP相對表達水平t值P值ISO-Ad-shCtrl3.32±0.11ISO-Ad-shUSP12.03±0.25?8.180.0012PBS-Ad-shCtrl1.00±0.21?16.95<0.0001PBS-Ad-shUSP11.32±0.31

注：與ISO-Ad-shCtrl組比較，*P<0.05

類別BNP相對表達水平t值P值ISO-Ad-shCtrl3.81±0.65ISO-Ad-shUSP11.75±0.34?7.3180.0019PBS-Ad-shCtrl1.00±0.19?12.220.0003PBS-Ad-shUSP11.02±0.20

注：與ISO-Ad-shCtrl組比較，*P<0.05

3 討論

心血管疾病已經成為威脅人類健康最主要的風險因素。心肌肥厚是個復雜的過程，心肌細胞的結構，功能，信號通路，轉錄，電生理，代謝都發生了變化，是包括高血壓和心率不齊在內的多種心血管疾病所共有的病理學基礎[10]。成年個體心肌細胞增殖的能力有限，當心肌負荷增加的時候，心肌細胞做出相應的反應，通過增大心肌細胞和心臟大小來代償性地滿足機體的需求，即出現心肌肥厚。心肌肥厚分為生理性心肌肥厚和病理性心肌肥厚。體育鍛煉和懷孕可導致心肌肥厚并伴以正常或增強的心肌收縮功能，這種類型的心肌肥厚為生理性并且可逆。而病理性肥厚是由于長期異常的血流動力學應激、高血壓、心肌梗死等因素引起的。病理性心肌肥厚便隨著心肌纖維化、毛細管膨脹、炎癥、心肌細胞功能障礙以及表現遺傳調控紊亂,其他細胞如成纖維細胞，血管平滑肌細胞，內皮細胞也對刺激產生復雜的反應，最終導致纖維化，炎性細胞浸潤，內皮功能紊亂及血管僵硬[11,12]，這一系列復雜的反應最終導致心肌適應不良、心臟重構和心臟衰竭[1]。

病理性心肌肥厚是心力衰竭的重要危險因素，它與間質纖維化、細胞死亡和心功能障礙有關。長期以來，病理性心肌肥厚被認為是不可逆的。然而，最近的臨床觀察和實驗研究已經表明病理性心肌肥厚也是可以被逆轉。在心力衰竭患者中，將左心室輔助裝置用于搭橋移植不僅能改善周圍血液循環而且誘導肥厚心臟三維結構的逆向重構和功能恢復[13]。此外，在飲食中添加生理水平的銅可以逆轉小鼠的病理性心肌肥厚。壓力過載導致心臟中同型半胱氨酸的積累，并伴隨著銅-同型半胱氨酸復合物的形成和復合物的排泄而耗盡銅。補充銅可恢復細胞色素c氧化酶(CCO)活性，促進心肌血管生成，同時使心肌肥厚消退，心肌收縮功能恢復[14]。因此，將病理性心肌肥厚逆轉的概念轉化為臨床實踐的時代即將來臨。但是，目前我們對心肌肥厚發生發展的病理學機制了解并不全面。深入理解病理性心肌肥厚的發病機制將為逆轉心肌肥厚治療部分心血管疾病提供充分的理論支撐。

本研究主要發現USP1在心肌肥厚的細胞中高表達，并且干擾USP1可以有效的抑制心肌肥厚。USP1基因位于人類1號染色體短臂3區1帶3亞帶(1p31.3)，在靈長類中高度保守。目前研究發現USP1可以調節多種生物學功能，其主要作用機制是使靶蛋白去泛素化。USP1最早發現其可以通過穩定FANCD2基因，影響基因組穩定性參與Fanconi貧血表型[4,5]。進一步研究發現，USP1穩定FANCD2蛋白需要UAF1參與，USP1/UAF1復合物使USP1發揮功能的基礎[15]。USP1與UAF1形成復合物，通過對底物進行去泛素化而穩定靶蛋白，進而影響細胞功能。USP1/UAF1可以使穩定靶蛋白TBK1去泛素化，穩定TBK1蛋白水平進而增強細胞的抗病毒反應[15]；USP1/UAF1復合物也可以通過同樣的方式，穩定RAD51AP1蛋白，進而促進細胞DNA的重組修復[16]。USP1/UAF1復合物還可以與人乳頭瘤病毒E1解旋酶相結合，促進病毒基因組的單向復制[17]。近期發現USP1可以參與腫瘤的發生發展。在乳腺癌中，抑制USP1的活性可以使KPNA2蛋白穩定，進而抑制乳腺癌的轉移[18]。進一步的研究發現，USP1對BRCA1缺陷的乳腺癌細胞中DNA復制叉的起始相關[19]。研究發現，USP1可以通過EZH2蛋白穩定性，進而調節EZH2的活性以及β-catenin信號通路活性[7]。而在白血病細胞中，USP1可以和BcrAbl細胞的PH結構域相互結合，參與細胞重編程[20]。但USP1在心血管系統中的作用研究尚未見報道。本次研究首次發現在ISO誘導的心肌肥厚模型中USP1的mRNA水平和蛋白表達升高，使用腺病毒介導的USP1干擾可以有效抑制ISO誘導的乳大鼠心肌細胞的面積和心肌肥厚標志分子Anp和Bnp的表達水平。這說明USP1在ISO誘導的心肌肥厚過程中是必須的。

雖然本次研究首次發現USP1可能參與心肌肥厚的發生發展，但USP1如何發揮功能尚待進一步探討。研究表明，去泛素化家族在心肌肥厚中發揮重要作用。在心肌特異型過表達USP15的小鼠中研究發現，USP15可以通過去泛素化SLIM1并穩定該蛋白，進而促進心肌重塑，誘導心肌肥厚的發生[21]。與之相反，過表達USP14可以有效的抑制心肌肥厚的進程，敲低USP14可以激活TAK1/JUK1/2/P38信號通路，導致心肌肥厚的發生[22]。另外，在心肌創傷后導致的心肌肥厚病理性瘢痕中，干擾USP4的表達或者抑制其活性均可以抑制心肌肥厚導致的病理性瘢痕的形成，該過程通過USP4對TGFβ受體1和Smad蛋白去泛素化并增加其穩定性進而激活TGFβ/Smad信號通路實現[23]。以上分析發現USP家族不同成員在心肌肥厚發生發展過程中發揮不同的功能。

本研究目前研究初步發現USP1可以促進心肌肥厚的發生，但是其作用機制尚不明確。如上所述，USP1可以與UFA1組成復合物發揮功能，但是USP1在誘導心肌肥過程中是否通過與UFA1形成復合物發揮功能尚待進一步的探討。此外，在USP1誘導的心肌肥厚中，USP1的靶基因需要進一步鑒定，并且鑒定USP1是否通過去泛素化并穩定靶蛋白發揮作用。明確USP1的功能和作用機制還需要再轉基因動物水平進行進一步驗證，深入探討USP1調控心肌肥厚的作用機制。綜上所述，本研究主要在ISO可以誘導心肌肥厚的過程中，USP1表達上升，靶向USP1可以有效的抑制ISO誘導的心肌肥厚。但USP1參與心肌肥厚的發生發展的詳細作用機制有待深入研究。本研究可能為對于進一步闡明心力衰竭的發生發展機制，尋找防治心力衰竭的藥物靶點具有非常重要的理論和臨床意義。