薯蕷皂苷調控miR-146a表達抑制高糖誘導的大鼠視網膜血管內皮細胞損傷機制研究

吳貴福 董春萍 高珊 李輝

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病初期的微血管并發癥，已成為主要的致盲性疾病之一。DR的發病機制尚不十分明確，一般認為高血糖是引起糖尿病患者視網膜損傷的重要因素[1]，細胞凋亡和氧化應激貫穿DR發病的過程。流行病學調查顯示，我國糖尿病患者居全球首位，DR發病呈增長趨勢，嚴重影響患者視力健康[2]。DR治療方法或手段較多，西藥治療存在一定的局限性，不能從根本上治愈DR。由于中草藥具有低毒、不良反應少等優點，中醫療療法在DR的治療中得到廣泛應用[3]。薯蕷皂苷是中藥穿山龍的有效成分，具有抗炎、鎮痛、調節免疫等作用，其對糖尿病周圍神經病變的防治作用也日益受到關注[4]。研究表明，薯蕷皂苷可增強糖尿病合并頸動脈粥樣硬化患者血清SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性，清除血液及組織中的氧自由基及MDA，防止血管內皮的氧化損傷[5]。薯蕷皂苷可提高氧化低密度脂蛋白誘導的血管內皮細胞eNOS表達，促進NO的合成與釋放，從而降低血管內皮細胞的凋亡[6]。微小RNA(micro RNA，miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，參與多種疾病的發生、發展。研究表明，miR-146a在糖尿病周圍神經病變患者外周血中的含量降低，且miR-146a低表達與患者的病情嚴重程度密切相關[7]。miR-146a在DR患者血清中表達降低，NF-κB和VEGF明顯增加，miR-146a可能通過介導炎癥反應和血管增生參與DR的發病過程[8]。目前，薯蕷皂苷和miR-146a對高糖誘導的大鼠視網膜血管內皮細胞(RRVEC)損傷的影響，以及薯蕷皂苷是否通過調控miR-146a影響大鼠RRVEC損傷還未見報道。本研究主要探討了薯蕷皂苷對高糖誘導的大鼠視網膜血管內皮細胞損傷的影響及作用機制，以期為DR的治療提供新的作用靶點和新型藥物的開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 清潔級SD大鼠，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號:SCXR(京)2015-005。薯蕷皂苷粉由國家天然藥物研究中心提供，純度為98%；胎牛血清(FBS)和L-DMEM培養基美國Gibico公司；熒光(Cy3)標記羊抗兔IgG購自武漢博士德生物有限公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自Invitrogen公司；引物序列由寶生物工程(大連)有限公司 提供；BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天公司；Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3以及內參GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；ROS、SOD和MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；LipofectamineTM2000試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RRVEC細胞培養和鑒定:參照文獻方法分離培養RRVEC細胞[9]。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，脫頸椎處死，頭部常規消毒，取出完整眼球。75%酒精消毒30 s，加入預冷的含200 U/ml青霉素和鏈霉素的PBS沖洗，去除血污。然后置于含預冷的PBS紗布的培養皿中，獲取視網膜組織，剪碎，加入培養液進行培養。視網膜組織加入0.1% Ⅰ型膠原酶溶液37℃消化0.5 h，網孔為100 μm的兩層不銹鋼細胞濾網過濾。收集洗脫液，室溫離心(1 500 r/min、5 min)。棄上清液，沉淀加入含肝素鈉和胎牛血清的改良培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。取第4代RRVEC細胞，以1×104個/ml接種于涂有明膠的蓋玻片上，培養24 h。細胞貼壁后，取出蓋玻片，免疫細胞熒光染色法鑒定RRVEC細胞。以PBS代替一抗作為陰性對照組，加入Cy3二抗工作液，37℃孵育顯色，熒光顯微鏡觀察。陽性表達時Cy3發出紅色熒光。

1.2.2 RRVEC細胞分組:對數生長期的RRVEC細胞，以1×105個/ml濃度接種于6孔板中，每孔1 ml，貼壁后分組處理。實驗設置5個組，對照組：含10%FBS的L-DMEM培養基培養24 h；高糖組：含25 mmol/L葡萄糖、10%FBS的L-DMEM培養基培養24 h；高糖+薯蕷皂苷-低組：含25 mmol/L葡萄糖、4.8μg/ml薯蕷皂苷[6]、10%FBS的L-DMEM培養基共同培養24 h；高糖+薯蕷皂苷-中組：含25 mmol/L葡萄糖、12 μg/ml薯蕷皂苷、10%FBS的L-DMEM培養基共同培養24 h；高糖+薯蕷皂苷-高組：含25 mmol/L葡萄糖、30 μg/ml 薯蕷皂苷、10%FBS的L-DMEM培養基共同培養24 h。培養結束后，收集各組細胞用于后續實驗。

1.2.3 細胞轉染:對數生長期的RRVEC細胞，以1×105/ml濃度接種于6孔板中，每孔1 ml。待細胞融合至60%時，利用LipofectamineTM2000參照其說明進行轉染，分別轉染miR-NC、miR-miR-146a，細胞分為miR-NC組和miR-146a組。培養6 h后，更換培養基，繼續培養48 h后收集細胞用于后續實驗。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡:取分組處理后的細胞，PBS清洗后重懸并計數。取5×104～1×105個重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-FITC 結合液重懸，再加入5 μl Annexin V-FITC，混合均勻，室溫避光反應10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清。再加入190 μl Annexin V-FITC 結合液重懸，10 μl碘化丙啶染色液，4℃避光孵育60 min后上機檢測，Expo32軟件分析，計算細胞凋亡率。

1.2.5 Western Blot法檢測蛋白表達:取分組處理后的細胞，加入蛋白裂解液置于冰上充分裂解，4℃、12 000 r/min離心10 min。收集上清液，BCA法測定蛋白含量。取適量蛋白質，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，進行SDS-電泳。電泳結束后，將分離的蛋白轉移至PVDF膜，室溫條件下5%脫脂牛奶封閉2 h。TBST洗膜后，加入一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，滴加ECL顯影液。曝光拍照，BandScan分析條帶灰度值。以GAPDH為內參，目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.2.6 細胞ROS、SOD和MDA水平檢測:取分組處理后的細胞，參照文獻方法[9]，采用流式細胞儀檢測細胞中ROS相對含量。酶聯免疫吸附法檢測細胞中SOD活力和MDA含量，操作過程嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.2.7 qRT-PCR檢測miR-146a表達:取分組處理后的細胞，Trizol試劑提取總RNA，反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。miR-146a上游引物序列5’-TGAGAACTGAATTCCATGGGTTA-3’，下游引物序列 5’-TGAGAACTGAATTCCATAGGCTA-3’；U6上游引物序列，5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物序列5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。擴增條件為：95℃預變性30 s;95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行40個循環。以U6為內參，采用 2-ΔΔCt法計算miR-146a的相對表達水平。

2 結果

2.1 薯蕷皂苷對高糖誘導的RRVEC凋亡的影響 流式細胞儀檢測薯蕷皂苷對高糖誘導的RRVEC細胞凋亡的影響，高糖組RRVEC細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。與高糖組比，薯蕷皂苷干預后，RRVEC細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，并且不同濃度薯蕷皂苷組間比較差異顯著(P<0.05)。Western Blot進一步檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3表達，結果顯示，與對照組比，高糖組Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)。與高糖組比，薯蕷皂苷干預后，RRVEC細胞Bcl-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.05)，且不同濃度薯蕷皂苷組間比較差異顯著(P<0.05)，說明薯蕷皂苷干預能促進高糖誘導的RRVEC細胞Bcl-2蛋白表達，抑制Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表達。見圖1、2，表1。

圖1 凋亡相關蛋白表達

圖2 薯蕷皂苷對高糖誘導的RRVEC凋亡的影響，細胞凋亡流式圖

表1 薯蕷皂苷對高糖誘導的RRVEC凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-低組組比較，△P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-中組比較，☆P<0.05

2.2 薯蕷皂苷對高糖誘導的RRVEC中ROS水平、SOD活性、MDA含量的影響 流式細胞儀檢測RRVEC細胞中ROS相對含量，酶聯免疫吸附法檢測SOD活性以及MDA含量，高糖組RRVEC細胞中ROS水平和MDA含量明顯高于對照組(P<0.05)，SOD活性明顯低于對照組(P<0.05)，而薯蕷皂苷干預后，RRVEC細胞中ROS水平和MDA含量明顯低于高糖組(P<0.05)，SOD活性明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

組別ROS水平(%)SOD活性(U/mg)MDA含量(nmol/mg)對照組100.00±0.00156.87±9.683.67±0.31高糖組198.74±13.52?78.64±8.03?9.81±0.72?高糖+薯蕷皂苷-低組177.29±11.43#95.38±9.14#8.12±0.64#高糖+薯蕷皂苷-中組159.37±10.26#△114.39±9.96#△6.88±0.47#△高糖+薯蕷皂苷-高組134.34±9.74#△☆131.67±8.63#△☆4.85±0.42#△☆ F值214.507168.704320.791 P值0.0000.0000.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-低組組比較，△P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-中組比較，☆P<0.05

2.3 薯蕷皂苷對高糖誘導的RRVEC中miR-146a表達的影響 采用qRT-PCR檢測RRVEC細胞中miR-146a表達，高糖組miR-146a表達水平明顯低于對照組(P<0.05)。與高糖組比，薯蕷皂苷干預后，RRVEC細胞miR-146a表達明顯升高(P<0.05)，且呈濃度依賴性。見表3。

組別miR-146a對照組1.04±0.08高糖組0.18±0.03?高糖+薯蕷皂苷-低組0.37±0.04#高糖+薯蕷皂苷-中組0.59±0.05#△高糖+薯蕷皂苷-高組0.81±0.08#△☆ F值492.008 P值0.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-低組組比較，△P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷-中組比較，☆P<0.05

2.4 miR-146a過表達對高糖誘導的RRVEC損傷的影響 分別轉染miR-NC和miR-146a至高糖誘導后RRVEC細胞，qRT-PCR法檢測miR-146a水平驗證轉染效率，高糖+miR-146a組RRVEC細胞中miR-146a水平明顯高于高糖+miR-NC組(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，高糖+miR-146a組RRVEC細胞凋亡率明顯低于高糖+miR-NC組(P<0.05)。Western Blot檢測結果顯示，與高糖+miR-NC組比，高糖+miR-146a組RRVEC細胞中Bcl-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.05)。流式細胞儀檢測RRVEC細胞中ROS相對含量，酶聯免疫吸附法檢測MDA含量和SOD活性，結果顯示，與高糖+miR-NC組比，高糖+miR-146a組RRVEC細胞中ROS水平和MDA含量明顯降低(P<0.05)，SOD活性明顯提高(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 凋亡相關蛋白表達

表4 miR-146a過表達對高糖誘導的RRVEC損傷的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖+miR-NC組比較，#P<0.05

2.5 抑制miR-146a表達逆轉了薯蕷皂苷(30 μg/ml)對高糖誘導的RRVEC損傷的影響 分別轉染anti-miR-NC和anti-miR-146a至高糖誘導后RRVEC細胞，再使用30μg/ml的薯蕷皂苷干預轉染后的高糖誘導的RRVEC細胞，qRT-PCR檢測miR-146a水平，結果顯示，高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-146a組RRVEC細胞中miR-146a水平明顯低于高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-146a組RRVEC細胞凋亡率明顯高于高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組(P<0.05)。Western Blot檢測結果顯示，與高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組比，高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-146a組RRVEC細胞中Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測RRVEC細胞中ROS相對含量，酶聯免疫吸附法檢測MDA含量和SOD活性，結果顯示，與高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組比，高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-146a組RRVEC細胞中ROS水平和MDA含量明顯升高(P<0.05)，SOD活性明顯降低(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 凋亡相關蛋白表達

3 討論

細胞凋亡在DR的發生、發展中起重要作用。糖尿病視網膜損傷最早發生在視網膜血管內皮細胞(RRVEC)，高血糖代謝紊亂可導致RRVEC細胞凋亡，進而造成無細胞毛細血管結構的出現，以及毛細血管基底膜增厚、微動脈瘤形成等組織病理的改變[10-12]。降低高血糖引起的RRVEC細胞凋亡可能減輕DR，有利于疾病治療。本研究流式細胞儀檢測結果表明，高糖誘導RRVEC細胞后，細胞凋亡率明顯升高，與相關報道結果一致，說明高糖能夠促進RRVEC細胞凋亡。薯蕷皂苷干預高糖誘導的RRVEC細胞，細胞凋亡率明顯降低，且薯蕷皂苷越高，凋亡率越低，說明薯蕷皂苷可劑量依賴性抑制高糖誘導的RRVEC細胞凋亡。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白，兩者均在細胞凋亡過程中發揮重要作用[13]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3是多種凋亡程序啟動的執行者，其通過激活核內核酸酶裂解DNA片段，進而觸發凋亡，參與細胞凋亡的發生、發展過程[14]。Western Blot檢測結果顯示，高糖誘導后，RRVEC細胞中Bcl-2蛋白水平降低，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高，而薯蕷皂苷干預后，高糖誘導的RRVEC細胞中Bcl-2蛋白水平升高，Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低，提示薯蕷皂苷可能通過促進RRVEC細胞Bcl-2蛋白表達，抑制Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表達降低高糖誘導的RRVEC細胞凋亡。

注：與高糖組比較，*P<0.05；與高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組比較，#P<0.05

氧化應激在DR的發病過程中也起關鍵作用，其可通過多種機制造成RRVEC損傷[15]。拮抗氧化應激引起的RRVEC損傷是早起治療DR的新手段。大量活性氧自由基(ROS)的產生是氧化應激損傷的機制[16]。ROS可通過改變細胞結構和功能的完整性影響細胞功能[17]。丙二醛(MDA)是脂質過氧化產物之一，其含量高低可間接反映機體受自由基攻擊的嚴重程度[18]。超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶，其活性高低可反映機體清除ROS的能力[19]。同時，ROS的大量產生也會引起SOD活性的降低。本研究結果顯示，高糖誘導后，RRVEC細胞ROS水平和MDA含量升高，SOD活性降低，說明高糖誘導能夠引起RRVEC細胞產生氧化應激，損傷細胞。薯蕷皂苷干預高糖誘導的RRVEC細胞，細胞內ROS水平和MDA含量降低，SOD活性升高，并且呈濃度依賴性，提示薯蕷皂苷可能通過降低高糖誘導的RRVEC細胞氧化應激減輕對細胞的損傷。

miR-146a是miR-146家族成員之一，被普遍認為是一個與年齡有關、涉及血管重構過程的標志物[20]。研究表明，miR-146a與DR的關系十分密切。郝義等[21]研究發現，miR-146a在視網膜色素上皮細胞中表達水平降低，miR-146a過表達可抑制VEGF-A mRNA和蛋白表達水平，可能成為視網膜色素上皮細胞衰老的新型分子標記物。本研究qRT-PCR檢測結果顯示，高糖誘導的RRVEC細胞中miR-146a表達水平明顯降低，說明高糖誘導的RRVEC細胞中miR-146a呈低表達，miR-146a可能是治療DR的新靶點，提示促進RRVEC細胞中miR-146a表達可能有助于該疾病的治療。通過轉染miR-146a至高糖誘導后RRVEC細胞，構建miR-146a過表達的高糖誘導的RRVEC細胞，流式細胞儀檢測結果顯示，miR-146a過表達可抑制高糖誘導的RRVEC細胞凋亡。Western Blot檢測結果顯示，miR-146a過表達可促進高糖誘導的RRVEC細胞Bcl-2蛋白表達，抑制Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表達。此外，miR-146a過表達還能夠降低高糖誘導的RRVEC細胞中ROS水平和MDA含量，提高SOD活性，說明miR-146a過表達可保護高糖誘導的RRVEC細胞氧化損傷。為了進一步明確薯蕷皂苷是否通過調控miR-146a表達對高糖誘導的RRVEC細胞損傷發揮保護作用，qRT-PCR檢測檢測了薯蕷皂苷干預后高糖誘導的RRVEC細胞中miR-146a水平，結果顯示，薯蕷皂苷干預后，高糖誘導的RRVEC細胞miR-146a表達明顯升高，提示薯蕷皂苷可能促進高糖誘導的RRVEC細胞miR-146a表達。轉染anti-miR-NC和anti-miR-146a至高糖誘導后RRVEC細胞，再用30 μg/ml的薯蕷皂苷干預轉染后高糖誘導的RRVEC細胞，結果顯示，與高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-NC組比，高糖+薯蕷皂苷+anti-miR-146a組RRVEC細胞凋亡率、Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及ROS水平和MDA含量明顯升高，Bcl-2蛋白水平和SOD活性明顯降低，說明miR-146a過表達逆轉了薯蕷皂苷對高糖誘導的RRVEC細胞凋亡和氧化應激的影響，提示薯蕷皂苷通過調控miR-146a表達影響高糖誘導的RRVEC細胞損傷。

綜上所述，薯蕷皂苷可有效降低高糖誘導的RRVEC細胞凋亡和氧化應激，保護高糖誘導的RRVEC細胞損傷。高糖誘導的RRVEC細胞中miR-146a呈低表達，薯蕷皂苷可能通過促進RRVEC細胞miR-146a表達對高糖誘導的RRVEC細胞發揮保護作用。