高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定毛連菜中綠原酸和異綠原酸A及木犀草苷含量*

呂光輝，李星雨，葉方1,，黃良永，盧偉

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院藥學(xué)部，十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院藥學(xué)系，十堰 442000)

毛連菜(PicrisL.)為菊科毛連菜屬草本植物，主要活性成分為黃酮類、有機(jī)酸類、苷類和萜類物質(zhì)[1]，筆者擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改進(jìn)質(zhì)量控制方法，建立高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)測(cè)定毛連菜中綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A含量的方法，為深入開發(fā)該藥材的藥用價(jià)值提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 戴安UltiMateTM3000型HPLC儀(四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，紫外檢測(cè)器；Chromeleon軟件處理系統(tǒng))；頂帥FA2004型高速多功能粉碎機(jī)(上海市頂帥電器有限公司)；KM-410C型超聲清洗機(jī)(廣東科盟電器有限公司，最大可調(diào)功率250 W，40 kHz)；FA-2004電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，d=0.1 mg)；AUW-120D電子分析天平(日本島津公司，d=0.01 mg)。

1.2試藥 綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-200413，含量：100%)，異綠原酸A(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111782-201405，含量：92.0%)，木犀草苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111720-200905，含量：96.5%)；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為自制超純水。

1.3藥材 毛連菜樣品采自湖北省十堰市竹山縣，藥材由湖北醫(yī)藥學(xué)院葉方副教授鑒定為單毛毛連菜(P.hieracioidesL.subsp.fuscipilosa Hand.-Mazz)，全草洗凈干燥后粉碎，過三號(hào)篩[篩孔內(nèi)徑(355±13)μm]備用。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis T3柱(4.6 mm×150 mm，3 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫：0～10 min，3%→15%A，>10～40 min，15%→30%A。檢測(cè)波長(zhǎng)：348 nm；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。見圖1。

2.2溶液的配制

2.2.1對(duì)照品溶液的配制 精密稱取綠原酸對(duì)照品17.88 mg、異綠原酸A對(duì)照品12.58 mg，分別置10 mL量瓶，取木犀草苷對(duì)照品5.96 mg置25 mL量瓶，用甲醇溶解定容至刻度，即得濃度分別為1.788，1.258，0.238 mg· mL-1綠原酸、異綠原酸A及木犀草苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取3種對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL，置25 mL量瓶，用甲醇定容至刻度，混勻后以孔徑為0.22 μm濾膜過濾，得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的配制 精密稱取藥材粉末2 g，置具塞錐形瓶，精密加60%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(功率：250 W，頻率：40 kHz)提取40 min，用60%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，用孔徑0.22 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)3種混合對(duì)照品溶液適量，分別稀釋成每毫升含綠原酸596.000，298.000，149.000，74.500，37.250，9.313 μg；異綠原酸A419.333，209.667，104.833，52.417，26.208，6.552 μg；木犀草苷79.467，39.733，19.867，9.333，4.967，1.242 μg的混合對(duì)照品溶液，依照“2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定綠原酸、異綠原酸A及木犀草苷峰面積，以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得綠原酸的線性回歸方程為：Y綠=0.352 6X+1.397 7(R2=0.999 8)，異綠原酸A的線性回歸方程為：Y異=0.403X+2.132 8(R2=0.999 1)，木犀草苷的線性回歸方程為：Y木=0.552 5X+0.482 8(R2=0.999 6)。說明綠原酸的進(jìn)樣濃度在9.313～596.000 μg· mL-1、異綠原酸A的進(jìn)樣濃度在6.552～419.333 μg·mL-1、木犀草苷的進(jìn)樣濃度在1.242～79.467 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn) 將混合對(duì)照品溶液按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL，重復(fù)6次，測(cè)定綠原酸、異綠原酸A及木犀草苷的峰面積，結(jié)果3種對(duì)照品峰面積的RSD分別為0.81%，0.93%，0.89%，說明該儀器精密度良好。

1.綠原酸；2.木犀草苷；3.異綠原酸A。

1.chlorsgenic acid；2.glyphosate；3.isochlorogenic acid A.

Fig.1 HPLC chromatogram of Picris L.

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取毛連菜同一樣品(批號(hào)：20180805)粉末，按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，共計(jì)6份，依據(jù)“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定樣品中綠原酸、異綠原酸A和木犀草苷的峰面積，考察其重復(fù)性。結(jié)果綠原酸含量為0.186%，RSD=1.47%；異綠原酸A含量為0.142%，RSD=0.89%；木犀草苷含量為0.018%，RSD=0.93%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)：20180805)分別在制備后0，4，8，12，24 h按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL，依次測(cè)定綠原酸、異綠原酸A及木犀草苷的峰面積，結(jié)果綠原酸、異綠原酸A及木犀草苷的RSD分別為1.35%，1.57%，1.42%，說明該樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)：20180805)1 g共6份，置具塞錐形瓶，分別精密加入上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)，測(cè)定含量并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 綠原酸、木犀草苷及異綠原酸A加樣回收率結(jié)果

Tab.1 Recovery of chlorogenic acid，luteolin and isochlorogenic acid A

成分樣品稱重/g樣品含量加入量實(shí)測(cè)總量mg回收率平均回收率RSD%綠原酸1.036 51.9261.7883.70499.441.028 91.9121.7883.704100.231.017 41.8911.7883.710101.76100.281.261.025 91.9061.7883.68599.481.006 51.8701.7883.692101.881.007 51.8721.7883.64198.93木犀草苷1.036 50.1870.2380.432102.551.028 90.1860.2380.41997.791.017 40.1840.2380.42199.5099.951.541.025 90.1850.2380.424100.121.006 50.1820.2380.41999.491.007 50.1820.2380.421100.25異綠原酸A1.036 51.4691.2582.70998.571.028 91.4581.2582.745102.291.017 41.4421.2582.69499.53100.291.441.025 91.4541.2582.70199.131.006 51.4261.2582.703101.481.007 51.4281.2582.695100.73

2.4樣品測(cè)定 取批號(hào)為20180803，20180805，20180806的3批藥材，精密稱取樣品粉末2 g，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，按照外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中綠原酸、木犀草苷及異綠原酸A的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量

Tab.2 Sample content

%，n=3

3 討論

3.1樣品處理方法的選擇 在優(yōu)化樣品制備方法時(shí)參考相關(guān)文獻(xiàn)中方法對(duì)50%甲醇[2]、60%甲醇、70%甲醇[3]及50%乙醇、60%乙醇[4]、70%乙醇[3]進(jìn)行單因素比較，結(jié)果60%甲醇對(duì)3種成分綜合提取率較高。此外還考察了藥材提取后揮干溶媒再用甲醇復(fù)溶處理樣品，結(jié)果各色譜峰分離度、靈敏度等色譜屬性與超聲提取后直接進(jìn)行含量測(cè)定沒有明顯改善，最終采用60%甲醇超聲提取制備供試品。

3.2色譜條件的選擇 在優(yōu)化色譜條件時(shí)比較了323,327及348 nm[3]3個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)綠原酸、異綠原酸A和木犀草苷的響應(yīng)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種成分在348 nm波長(zhǎng)下響應(yīng)效果、分離度、重復(fù)性等均較好，所以確定348 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

在選擇色譜柱時(shí)分別采用了Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱、Waters Atlantis T3(4.6 mm×150 mm，3μm)色譜柱，結(jié)果Waters Atlantis T3色譜柱對(duì)指標(biāo)成分的分離度更高，靈敏度、專屬性、重復(fù)性等均較好，選擇作為毛連菜含量測(cè)定用色譜柱。

本實(shí)驗(yàn)所采用方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性、重復(fù)性、專屬性均較好，可作為毛連菜藥材質(zhì)量控制研究方法。