基于近紅外光譜指紋圖譜技術鑒別不同特征知柏地黃丸(濃縮丸)*

郭曉玉，張曉霞，謝彩俠，謝惠英，耿曉桐，雷敬衛

(1.河南中醫藥大學藥學院，鄭州 450046；2.鄭州鐵路職業技術學院藥學系，鄭州 451460)

知柏地黃丸(濃縮丸)是在六味地黃丸基礎上加黃柏和知母兩味藥而成，可滋陰降火，臨床上應用于多種疾病的治療[1]。由于該制劑生產廠家多，處方中藥味較復雜，在知柏地黃丸生產過程中，不同廠家所選用的輔料質量、藥材產地及生產工藝參數不盡相同，《中華人民共和國藥典》2015年版也并未對相關事項做明確要求，導致不同廠家知柏地黃丸質量有差異。中藥是多組分多靶點特殊藥品，《中華人民共和國藥典》2015年版僅用丹皮酚和馬錢苷含量是否合格作為評價知柏地黃丸(濃縮丸)質量的主要指標，并沒有體現中藥質量特征，也不能反映不同廠家知柏地黃丸(濃縮丸)差異；另外，中藥質量穩定性是決定中藥質量安全、有效的重要因素之一，它是中藥產品在特定的一段時間(有效期)內，保持化學、物理、微生物特性以及療效的能力[2]，目前關于藥品在存放及流通過程中一旦超過其規定有效期，其質量與有效期內中藥的差異研究筆者鮮見報道。本課題組前期利用高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜技術對3個廠家及不同放置時間的知柏地黃丸進行分析發現[3]，3個廠家樣品HPLC指紋圖譜的相似度較高，質量特征一致性較好，但利用HPLC指紋圖譜不能有效區分有效期內與有效期外知柏地黃丸樣品，因此亟待尋找一種可以有效鑒別由于輔料、工藝及放置時間等不同所引起差異的知柏地黃丸樣品，以規范市場上流通藥品的質量特征，防止超出有效期的藥品再次流入市場，給藥物的安全帶來隱患。近紅外光譜(near infrared reflectance spectroscopy，NIRS)技術是利用化學計量學方法將物質近紅外波段范圍的光譜指紋圖譜信息與其物理、化學及其他質量特征進行關聯，建立的一種快速、無損的綠色分析方法，可以反映物質整體的質量信息[4]。因此，近年來被廣泛用于中藥這一特殊藥品的定性鑒別及定量分析。本研究利用化學計量學方法，對不同廠家知柏地黃丸(濃縮丸)及同一廠家有效期內與有效期外的知柏地黃丸(濃縮丸)的NIRS指紋圖譜信息進行分析，試圖建立一種可以快速準確鑒別不同廠家、同一廠家有效期內和有效期外知柏地黃丸的方法，以期為建立一套符合中藥特點、簡便、準確的知柏地黃丸(濃縮丸)質量控制與評價體系提供依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Nicolet 6700型傅立葉變換近紅外光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Milli-Q Academic A 10型超純水機(美國Millipore公司)；AL 204型分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.1 mg)；CPA225D型十萬分之一分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司，感量：0.01 mg)；FW-100型高速萬能粉碎機(北京中興偉業儀器有限公司)；101-3AB型電熱鼓風干燥箱(北京中興偉業儀器有限公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 知柏地黃丸(濃縮丸)，收集市場上A、B、C3個廠家不同批次知柏地黃丸(濃縮丸)樣品82份，其中第1～61份為A廠家生產、第62～72份為B廠家生產，第73～82份為C廠家生產。藥品粉碎過60目篩(篩孔內徑0.25 mm)后置干燥器中，備用。

2 方法與結果

2.1實驗方法 首先，取樣品粉末5 g，采用積分球漫反射法，以空氣為參比、光譜范圍12 000～4000 cm-1、分辨率8 cm-1，溫度25 ℃、相對濕度20%～30%、掃描次數為32的掃描條件下，每個樣品重復5次，獲取82份知柏地黃丸(濃縮丸)樣品NIRS指紋圖譜；其次，選擇用于建立模型的校正集樣品和用于驗證模型的驗證集樣品，校正集與驗證集比例一般為5：1～ 3：1，以錯判個數和性能指數(performance index，PI)作為評價指標，考察不同光譜預處理方法及光譜范圍對NIRS指紋圖譜質量評價模型判別效果的影響，以確定最佳能夠區分不同廠家知柏地黃丸(濃縮丸)差異的光譜預處理方法及光譜范圍；最后，采用三重交叉驗證法，對所建立的NIR指紋圖譜判別分析模型進行準確性和適用性驗證。

A廠家知柏地黃丸(濃縮丸)放置一段時間后，有7份樣品超出藥品規定有效期，超出有效期的時間依次為17，12，11，9，9，7，1個月。為評價有效期內與有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)藥品差異，筆者采用NIRS評價方法對A廠家已過有效期的7份樣品及有效期內的30份代表性樣品的指紋圖譜進行分析。

2.23個廠家知柏地黃丸(濃縮丸)NIRS指紋圖譜的建立與分析

2.2.1校正集及驗證樣品的選擇 82份知柏地黃丸樣品NIRS指紋圖譜見圖1。分別從A廠家61份、B廠家11份和C廠家10份樣品中選擇51份、9份、8份作為校正集樣品，其他作為驗證集樣品。

2.2.2光譜預處理方法 合適的光譜預處理方法可以降低NIRS中的背景干擾，最大程度保留與樣品物理、化學性質相關的有效光譜信息，進而建立可以真實反映樣品相關信息的NIRS指紋圖譜，提高其分析模型的可靠性。筆者通過分析不同光譜預處理方法所建立的NIRS指紋圖譜評價模型的錯判個數及PI值優選最佳光譜預處理方法(表1)，由結果知，多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)+二階導數(second derivative，SD)+濾波法(norris derivative，ND)為最佳光譜預處理方法。

2.2.3光譜范圍的選擇 NIRS的光譜范圍較寬，不同范圍所反映的與樣品性質相關的有效信息不同。為選擇能代表樣品差異的特征光譜信息，以建立可靠的質量評價模型，筆者以不同波段范圍所建立的近紅外判別分析模型對不同廠家樣品的錯判個數及PI值來確定最佳光譜范圍(表2)，由結果可知最佳建模譜段為7575.57～4157.77 cm-1。

圖1 82份知柏地黃丸(濃縮丸)樣品近紅外光譜指紋圖譜疊加圖

Fig.1 Overlay chart of the near-infrared reflectance spectra of 82 batches ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills)

表1 不同光譜預處理方法對判別分析模型性能的影響

Tab.1 Effects of different pretreatment methods on the performance of discriminant analysis model

光譜預處理方法錯判個數PIConstant(原始光譜)093.7MSC(多元散射校正)094.2MSC+SD(二階導數)192.1MSC+SD+SG(卷積平滑)192.8MSC+SD+ND(濾波法)094.9MSC+FD(一階導數)093.1MSC+FD+ND194.8SNV(標準歸一化)093.7

表2 不同光譜范圍對判別分析模型性能的影響

Tab.2 Effects of different spectral ranges on the performance of discriminant analysis model

光譜范圍錯判個數PI6 039.04～4 008.95093.77 575.57～4 157.77094.99 903.65～4 008.95093.69 903.65～6 569.84092.7

2.2.4NIRS判別分析模型的建立 采用TQ Analyst 8.0版分析軟件中的判別分析法，采用MSC+SD+ND方法對光譜進行預處理，在7575.57～4157.77 cm-1波段范圍內建立3個廠家知柏地黃丸判別分析模型(圖2)，由圖2可知，利用所建立的NIRS判別分析模型可以將3個廠家知柏地黃丸(濃縮丸)樣品明顯分為3類，說明3個廠家樣品質量特征存在明顯差異。另外，由同一廠家不同批號樣品之間的距離可以看出，A、C廠家各自樣品之間的距離較接近，樣品之間差異較小，說明質量相對穩定，而B廠家不同批號樣品雖然聚在一起，但樣品之間距離較大，說明B廠家不同批號之間樣品質量存在一定差異。

圖2 不同廠家知柏地黃丸(濃縮丸)判別分析圖(○.A；□.B；△.C)

Fig.2 Discriminant analysis diagram ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills) from different manufacturers(○.A；□.B；△.C)

2.2.5模型的驗證 為驗證模型可靠性，筆者采用三重交叉驗證法，隨機將樣品均分為3組，依次取其中2組作為校正集，另一組作為驗證集(表3)，對模型準確性和適用性進行進一步檢驗(表4)，由表3和表4可知所建判別分析模型性能較好，可以用于快速鑒別3個廠家的知柏地黃丸(濃縮丸)。

表3 不同廠家知柏地黃丸(濃縮丸)三重交叉驗證的樣品信息

Tab.3 Samples ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills) from different manufacturers in triple cross validation

個

2.3A廠家有效期內與有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)NIRS指紋圖譜鑒別分析結果 按照“3.1”項下采集A廠家30份有效期內和7份有效期外的知柏地黃丸(濃縮丸)樣品，通過考察光譜預處理方法和建模波段，最終選擇光譜預處理方法為MSC+SG，建模波段為8003.94～4195.20 cm-1。利用TQ Analyst 8.0版分析軟件建立A廠家有效期內與有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)的近紅外判別分析模型(圖3)。由圖3可知，該模型可以將A廠家有效期內與有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)明顯分為兩類，說明兩種樣品之間由于物理化學性質差異導致其在8003.94～4195.20 cm-1波段范圍內的NIRS指紋圖譜不同。因此，利用該波段所反映的NIRS指紋圖譜信息可以有效鑒別有效期內與有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)樣品。另外，由圖3可知，有效期外知柏地黃丸(濃縮丸)樣品之間距離較大，這可能由于有效期外樣品出有效期的時間不同所致。

表4 不同廠家知柏地黃丸(濃縮丸)判別分析模型的三重交叉驗證結果

Tab.4 Results of discriminant analysis model ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills) from different manufacturers in triple cross validation

數據組合樣品數準確率/%組合Ⅰ 校正集(組1,2)55 驗證集(組3)27100組合Ⅱ 校正集(組2,3)55 驗證集(組1)27100組合Ⅲ 校正集(組1,3)54 驗證集(組2)28100

圖3 有效期內與有效外知柏地黃丸(濃縮丸)判別分析圖(□.有效期外樣品；△.有效期內樣品)

Fig.3 Discriminant analysis diagram of the expired or unexpiredZhibaiDihuangPills (concentrated pills) in the valid and expired period (□.the expired samples；△.the unexpired samples)

3 討論

中藥是基于中醫藥理論指導下的多組分相互協同作用從整體上治療疾病的的一種特殊藥品，具有復雜性、整體性等特征。《中華人民共和國藥典》2015年版中一般采用某個或某幾個化學成分含量的高低作為評價中藥質量是否合格的標準，并沒有體現中藥多組分、多靶點特征，因此并不能真實反映中藥臨床療效，導致中醫臨床常出現中藥質量檢測合格，但療效一般的“癥對方準藥不靈”現象，嚴重影響了患者對中藥的認可度。因此迫切需要構建一套符合中藥特點的質量控制與評價體系，以反映中藥整體質量特征, 保障其療效穩定與可控。質量源于設計，針對中藥的特殊性，研究者先后將色譜、光譜及生物指紋圖譜技術等結合多元統計分析方法應用于中藥的質量控制[5-8]，取得了一定的成效。NIRS指紋圖譜分析技術主要運用化學計量學軟件從樣品復雜的NIRS圖中提取和樣品性質相關的信息，建立光譜特征與樣品性質等之間關系的數學模型以分析樣品特征，在分析過程中將樣品進行簡單粉碎后即可掃描其NIRS，所反映的信息主要是中紅外光譜區基頻吸收的倍頻、合頻、差頻吸收帶疊加而成，它反映了樣品內部組分、電負性和氫鍵等化學信息和樣品色澤、黏度、密度、顆粒度、均勻度等物理信息，不僅樣品處理簡單，掃描速度快，而且可以從整體上對樣品性狀及質量做出初步綜合評價[4]。知柏地黃丸(濃縮丸)藥味多，質量特征復雜，處方中的藥材和輔料來源、制備工藝及藥品在市場中的流通時間等因素均影響其質量，《中華人民共和國藥典》2015年版以馬錢苷和丹皮酚作為控制其質量的指標。前期研究發現，不同廠家及放置不同時間(有效期內及有效期外)的知柏地黃丸(濃縮丸)HPLC指紋圖譜相似度較高，而且丹皮酚和馬錢苷含量均符合《中華人民共和國藥典》2015年版規定，因此無法科學區分及評價不同廠家知柏地黃丸(濃縮丸)藥品質量，而且對于流通時間超出有效期的知柏地黃丸(濃縮丸)樣品，該方法不能準確鑒別。本研究基于NIRS光譜特點及優勢，利用化學計量學知識對3個廠家及超出有效期不同時間的知柏地黃丸(濃縮丸)樣品的NIRS光譜指紋圖譜信息進行差異性分析。結果表明，利用NIRS指紋圖譜技術可以有效鑒別不同廠家及超出有效期之外的知柏地黃丸(濃縮丸)樣品，因此NIRS指紋圖譜技術可以有效表征知柏地黃丸(濃縮丸)藥品質量特征，規范其流通市場。

合理制定藥品的有效期是保證藥品有效、安全使用的重要前提，目前發達國家銷售的植物藥都明確標注有效期。中藥走出國門，走向國際市場，必須遵循國際行業標準，制定合理的有效期[9]。中藥成分復雜，而且在放置過程中可能由于包裝材料、外部環境等多方面影響產生復雜物理、化學及生物變化，選擇一種方法，可以真實、有效、全面地評價中藥在放置過程中所發生的一切變化，通過研究這種變化對中藥的安全性和臨床療效的影響來制定中藥的有效期，目前關于這方面的研究還很薄弱[10-11]，因此應該結合中藥特點，將現代多元分析方法應用到中藥有效期研究中，以建立一套科學合理的評價及制定中藥有效期的方法。