氯胺酮復合丙泊酚對大鼠抑郁改善作用及對STAT3信號通路表達的影響*

孫媛，王莉，王欣，毛瑞芬

(河北醫科大學第一醫院麻醉科，石家莊 050031)

大腦處理情感的關鍵部位為邊緣系統，其主要構成部分為杏仁核，杏仁核參與了機體情緒和行為的調節，為抑郁癥患者發病主要腦區[1-2]。研究顯示，抑郁癥患者杏仁核內部分細胞因子發生過量表達，造成炎癥反應信號路徑活化[3]。Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT)信號路徑為主要炎癥細胞因子將胞內信號激活的轉導路徑。大量研究顯示，JAK/STAT信號路徑可參與抑郁癥神經細胞分化、增殖、凋亡核神經突觸可塑性等病理進程[4-5]。丙泊酚有抗驚厥作用，氯胺酮是N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體拮抗藥，被廣泛用于危重患者和小兒麻醉手術。研究顯示，氯胺酮不僅有麻醉作用，還有快速抗抑郁作用，對難治性抑郁具有一定療效[6]。CHEN等[7]研究顯示，鏈脲佐菌素所致糖尿病的大鼠較正常大鼠抑郁表征明顯。筆者在本研究考察氯胺酮復合丙泊酚麻醉對鏈脲佐菌素所致大鼠抑郁癥狀的改善作用及對STAT3信號通路表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級Wistar雄性大鼠，6周齡，購自成都達碩實驗動物公司，實驗動物生產許可證號為SCXK(川)2018-33，體質量80～120 g，平均(108.17±6.37) g。常規飼養1周后開始實驗，大鼠分籠飼養，每籠5只，室溫22～26 ℃，相對濕度55%～65%，晝夜循環，保持光照12 h，大鼠灌胃、添加飼料及換水等由專人負責。

1.2試藥與儀器 鏈脲佐菌素(美國Sigma公司，批號：050814)，白細胞介素-6(IL-6)、IL-1β及糖蛋白130(glycoprotein 130,gp130)試劑盒(購自武漢華美生物公司，批號分別為1903052，1812006，1901007)，氯胺酮(福建古田制藥廠，批號：181213)，丙泊酚(意大利AstraZeneca公司，批號：A1890)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(杭州聯科生物公司，批號：181014)，信號轉導與轉錄激活子-3(total-STAT3)、Janus激活酶2(total-Jak2)試劑盒(武漢優爾生科技公司，批號分別為1901139，1902221)。

電熱恒溫鼓風干燥箱(型號：DHG-9023A)、數字顯示隔水式電熱恒溫培養箱(型號：PYX-DHS)、漩渦混合器(型號：XW-80A)、離心機(型號：TGL-168)由美國KIMBLE公司生產；全自動封閉式組織脫水機(型號：TSJ-Ⅱ)由常州中威電子儀器廠生產。

1.3實驗方法 采用隨機數字表法將大鼠分為正常對照組、模型對照組、氟西汀組及麻醉組，每組15只。麻醉組、模型對照組及氟西汀組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素60 mg·kg-1。藥物導致糖尿病，進而產生抑郁。28 d后麻醉組大鼠腹腔注射氯胺酮(10 mg·kg-1)和丙泊酚(80 mg·kg-1)，氟西汀組灌胃氟西汀溶液0.2 mg·(100 g)-1，正常對照組和模型對照組腹腔注射等劑量0.9%氯化鈉溶液，連續7 d。

1.4觀察指標 ①曠場實驗，給藥后1 d所有大鼠置于操作間，光線適度，環境安靜。待測前將大鼠分別置于新鼠籠，適應5 min，再將大鼠置于曠場箱中央方格，大鼠頭部方向一致，記錄5 min，再將大鼠取出，曠場箱采用清水與75%乙醇清洗后檢測第2只大鼠，記錄大鼠直立次數、穿格數和修飾次數。

②曠場實驗后將大鼠斷頸處死，選取前額皮質，酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測IL-6與IL-1β含量。

③Western blotting法檢測大鼠前額皮質腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)蛋白表達，選取坐骨神經組織，研磨，經組織裂解后上樣電泳，起始電壓80 V，溴酚藍染料前緣進入到分離膠上緣后電壓提升到100 V，溴酚藍泳出分離膠下緣后電泳結束。半干電轉移儀于聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜內行蛋白質電轉移，恒流30 mA，連續90 min。PVDF膜取出后采用5%TBST緩沖液(TBST Buffer)脫脂奶粉封閉，震蕩60 min。結束封閉后采用TBST漂洗液洗膜10 min，3次，膜轉移到雜交袋內，加入適量漂洗液稀釋抗體，封口后4 ℃下孵育過夜；TBST漂洗液洗膜10 min，3次，再加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，震蕩60 min。PVDF膜放置在電化學發光(electrochemi luminescence，ECL)顯色液內震蕩溫育5 min，暗室下曝光、顯影及定影。清水沖洗，晾干掃描，Image-Pro Plus(IPP)軟件對掃描圖像目的條帶行灰度分析。

④選取杏仁核組織，ELISA法檢測total-STAT3、TNF-α、total-Jak2及gp130含量，試劑盒中標準品稀釋后加至酶標板標準品孔，大鼠杏仁核組織研磨后的上清液樣品加入樣品孔，每孔10 μL，膠紙將反應孔封住，37 ℃下孵育2 h，洗板5次，再加入生物素化抗體工作液10 μL，37 ℃下孵育1 h，洗板5次，加入酶結合物工作液10 μL，37 ℃下避光孵育30 min，洗板5次，每孔加入顯色液10 μL，37 ℃下避光孵育20 min，最后加入終止液，混勻后檢測吸光度(A450)值，以標準品濃度為橫坐標，以A值為縱坐標，繪制標準曲線，依據樣品A值于標準曲線內查看其濃度。

2 結果

2.1曠場實驗結果 見表1。與正常對照組比較，模型對照組大鼠直立次數、穿格數和修飾次數減少；與模型對照組比較，氟西汀組、麻醉組大鼠直立次數、穿格數和修飾次數增加，均差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 4組大鼠曠場實驗中直立次數、穿格數和修飾次數比較

組別直立次數穿格個數修飾次數正常對照組8.02±2.1956.30±10.757.16±1.83模型對照組3.99±2.05①14.93±10.28①1.45±1.69①氟西汀組10.10±2.21②54.20±10.18②6.83±1.58②麻醉組9.26±2.18②52.17±10.46②6.40±1.76②

①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

2.2前額皮質IL-6與IL-1β含量 見表2。與正常對照組比較，模型對照組前額皮質IL-6與IL-1β含量升高；與模型對照組比較，氟西汀組、麻醉組大鼠前額皮質IL-6與IL-1β含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3前額皮質BDNF表達情況 正常對照組、模型對照組、氟西汀組及麻醉組前額皮質BDNF表達分別為(100.00±0.00)%、(61.07±3.29)%、(86.31±3.15)%及(84.19±3.26)%。與正常對照組比較，模型對照組前額皮質內BDNF表達降低；與模型對照組比較，氟西汀組、麻醉組大鼠前額皮質內BDNF表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4杏仁核total-STAT3、TNF-α、total-Jak2及gp130含量 見表3。與正常對照組比較，模型對照組total-STAT3、TNF-α及gp130含量升高；與模型對照組比較，氟西汀組、麻醉組total-STAT3、TNF-α及gp130含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 4組大鼠前額皮質內IL-6與IL-1β含量比較

組別IL-6IL-1β正常對照組60.03±6.1559.27±4.10模型對照組81.37±6.30①80.25±4.17①氟西汀組61.82±6.26②62.15±4.20②麻醉組63.25±6.31②64.26±4.39②

①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

表3 4組大鼠杏仁核total-STAT3、TNF-α、total-Jak2及gp130含量比較

組別total-STAT3/(ng·mL-1)TNF-α/(pg·mL-1)正常對照組2.83±1.01133.52±16.81模型對照組6.19±1.36①239.08±16.37①氟西汀組3.10±1.25②176.81±16.29②麻醉組3.58±1.07②186.62±16.40②組別total-Jak2gp130(ng·mL-1)正常對照組1.01±0.6827.18±4.08模型對照組1.64±0.70116.03±4.36①氟西汀組1.21±0.69②64.39±4.21②麻醉組1.25±0.7168.05±4.72②

①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

3 討論

CHEN等[7]研究發現，鏈脲佐菌素所致糖尿病大鼠較正常大鼠抑郁表現明顯。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組大鼠直立次數、穿格數和修飾次數減少；與模型對照組比較，麻醉組大鼠直立次數、穿格數和修飾次數增加，均差異有統計學意義，提示鏈脲佐菌素致大鼠糖尿病能構建抑郁模型。

糖尿病為臨床常見病，相關流行病學研究顯示，世界范圍內5%～7%人罹患糖尿病[8]。當前，糖尿病所致認知功能受損、抑郁等腦功能障礙逐漸受到關注。WAYHS等[9]研究顯示，糖尿病所致抑郁模型動物海馬組織的氧化應激指標水平顯著增高。此外有研究顯示，羅格列酮為臨床常用增強胰島素敏感、治療胰島素抵抗類藥物，可治療糖尿病所致抑郁[10]。本實驗結果顯示，糖尿病模型大鼠前額皮質IL-6、IL-1β表達明顯升高，可能與激活炎癥反應與氧化應激有關。丙泊酚有抗驚厥作用，氯胺酮具有確切抗抑郁作用，本研究結果顯示，經氯胺酮和丙泊酚干預后，大鼠前額皮質IL-6與IL-1β含量降低，與相關研究結果一致[11]。此外，筆者在本研究對氯胺酮與丙泊酚對糖尿病大鼠抑郁癥狀、相關因子表達改變進行分析。NIBUYA等[12]研究顯示，急慢性應激反應均可導致中樞神經系統BDNF表達降低，同時抗抑郁藥物能夠對BDNF降低起干預作用。本研究結果顯示，氯胺酮聯合丙泊酚的抗抑郁作用也可能與前額皮質BDNF升高有關。

正常生理情況下，中樞神經TNF-α能夠對睡眠、學習記憶和神經元突觸可塑性等進行調節，病理狀況下，中樞膠質細胞尤其為小膠質細胞可分泌大量TNF-α，參加發生中樞精神障礙性疾病[13-14]。TNF-α參加精神障礙性疾病機制有以下幾個因素，一為TNF-α可將相關信號路徑激活，造成神經元變性或凋亡，如p38 MAPK、NF-κB、Jnk、ERK等通路；二為導致神經突觸抑制性與興奮性比例不平衡。但JAK/STAT信號轉導路徑不但為主要跨膜信號轉導路徑，也是激活機體炎性細胞因子最關鍵路徑。研究表明，TNF-α能借助細胞膜表層gp130蛋白激活JAK/STAT信號通路，進而調節中樞神經系統[15]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組total-STAT3、TNF-α及gp130含量升高；與模型對照組比較，麻醉組大鼠total-STAT3、TNF-α及gp130含量降低，提示氯胺酮聯合丙泊酚可降低JAK/STAT信號通路內STAT3蛋白表達，抑制TNF-α過表達，改善大鼠抑郁癥狀。

綜上所述，氯胺酮復合丙泊酚麻醉可顯著改善鏈脲佐菌素所致大鼠抑郁，其作用機制可能與調節JAK/STAT信號路徑、降低炎癥細胞因子含量有關。本研究僅檢測了大鼠STAT3與JAK2蛋白含量改變情況，未檢測磷酸化STAT3與JAK2蛋白，一定程度難以反映STAT3與JAK2蛋白活化情況。今后還需對此模型磷酸化STAT3與JAK2蛋白進行探究。