異綠原酸B對肝損傷小鼠的保護作用及其機制*

劉鑫，牛子冉，梅丹，張波

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院藥劑科，北京 100730；2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

近年來，隨著生活水平提高以及人口老齡化，我國心血管疾病患病率呈逐年上升趨勢[1]。降脂治療可顯著降低心血管事件和病死率。阿托伐他汀(atorvastatin，ATO)屬于他汀類降脂藥，其通過競爭性抑制膽固醇合成限速酶從而降低體內膽固醇和脂蛋白水平，降低心血管危害發生率，是目前最暢銷的藥物之一[2-4]。然而，肝酶升高和橫紋肌溶解等不良反應限制了其臨床應用[5-6]。

異綠原酸B(isochlorogenic acid B，ICAB)是來源于藥用植物金銀花的一種多酚類化合物，本課題組以往的研究表明，ICAB對四氯化碳致急性肝損傷小鼠具有保護作用[7]。氧化應激與肝臟疾病的發生、發展密切相關。核轉錄因子NF-E2相關因子/抗氧化反應元件(NF-E2-related factor 2/ antioxidant response element，Nrf2/ARE)氧化應激信號通路的激活在防治化學性、藥物性和免疫性肝損傷及肝臟腫瘤中發揮重要作用[8]。筆者在本研究建立ATO誘導小鼠肝損傷模型，評價ICAB的肝保護作用，并基于Nrf2/ARE信號通路探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 ICAB購自上海源葉生物科技有限公司(批號：B21540，HPLC法檢測含量>98%)；ATO購自大連美侖生物科技有限公司(批號：120531H，分析純)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT，批號：20141214)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST，批號：20141216)、丙二醛(MDA，批號：20141029)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：20141106)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px，批號：20141108)試劑盒購自南京建成生物技術研究所；蛋白濃度測定試劑盒(批號：P00112S)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel/eletrophoresis,SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(批號：P0012A)和2×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate，SDS)蛋白上樣緩沖液(批號：P0015A)購自碧云天生物技術研究所；Nrf2抗體購自Santa Cruz公司(批號：K2008)；β-actin單克隆抗體(批號：TA09)購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2動物分組及給藥 無特定病原體(SPF)級昆明種雄性小鼠，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001。小鼠常規飼養，自由飲水，實驗開始前適應性飼養1周。將小鼠隨機分為5組：空白對照組、模型對照組和ICAB小、中、大劑量組(5，10和20 mg·kg-1)，每組10只。

ICAB用0.9%氯化鈉溶液配成相應濃度溶液。具體給藥方案如下：除空白對照組外，其他各組灌胃給予ATO 12 mg·kg-1·d-1。ICAB小、中、大劑量組同時灌胃給予相應劑量ICAB，qd；空白對照組和模型對照組灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液，qd。均連續9 d，9 d后小鼠禁食過夜，次日經頸動脈取血，血樣1400×g離心10 min，分離血清，凍存于-80 ℃冰箱備用。取肝臟大葉同一部位，10%甲醛固定，蘇木精-伊紅(HE)染色，病理學檢查。剩余肝組織置于液氮冷凍，存于-80 ℃冰箱備用。

1.3小鼠血清ALT與AST水平測定 取小鼠血清，按試劑盒說明測定。

1.4肝生化指標測定 取小鼠肝組織，冰浴，以 9倍體積0.9%氯化鈉溶液制成肝勻漿，-4 ℃、13 400×g離心15 min，去除細胞核和細胞碎片。取上清液，分裝，測定蛋白濃度，-80 ℃保存備用。分光光度法測定肝組織勻漿MDA、GSH含量及SOD和GSH-Px活性。

1.5肝組織病理學檢查 取各組小鼠肝臟同一部位，10%甲醛固定，常規石蠟包埋切片，HE染色，進行病理學檢查。

1.6Western blotting印跡法檢測Nrf2蛋白表達 按步驟分別提取細胞總蛋白和細胞核內蛋白，二喹啉甲酸(bicin choninic acid,BCA)法測定蛋白含量，加入SDS上樣品緩沖液，煮沸10 min；以同等蛋白量進行SDS-PAGE 電泳，然后轉聚偏二氟乙烯膜；5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；ECL化學發光顯影液發光，儀器攝影。

1.7免疫熒光技術觀察Nrf2核轉位 取肝組織石蠟切片，用預冷磷酸緩沖鹽溶液洗3次，于37 ℃孵箱封閉1 h。4 ℃孵一抗過夜。預冷1×PBS洗3次，每次5 min，孵二抗于37 ℃ 避光30 min；加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染料，蓋玻片覆蓋，熒光顯微鏡下攝影。

1.8實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測血紅素加氧酶(heme oxygenase 1，HO-1)、醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase,NQO1)和谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞單位(glutamyl semidomine ligase catalyzed subunit，GCLC)表達 按照試劑盒說明書抽提肝組織總RNA，測定A260/A280為1.8～2.0，純度>90%后進行逆轉錄反應合成cDNA，然后擴增HO-1、NQO1、GCLC mRNA。按PCR試劑盒操作，PCR反應體系為25 μL。具體擴增條件如下：94 ℃預變性2 min，(94 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s)×39個循環。根據標準曲線求得閾值循環數(cycle threshhold，Ct)值，使用β- actin校正后求得△Ct，根據2-△△Ct計算HO-1、NQO1和GCLC相對表達量。

2 結果

2.1ICAB對小鼠血清ALT和AST水平的影響 結果顯示，與空白對照組比較，模型對照組小鼠血清ALT和 AST水平均明顯升高(P<0.01)，提示ATO誘導小鼠肝損傷造模成功。與模型對照組比較，ICAB 不同劑量組小鼠血清ALT與AST水平均明顯降低(P<0.01)，結果見圖1。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.ICAB小劑量組；D.ICAB中劑量組；E.ICAB大劑量組；①與空白對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01。

A.blank control group；B.model control group；C.ICAB low-dose group；D. ICAB median-dose group；E.ICAB high-dose group；①Compared with blank control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01.

2.2ICAB對小鼠肝臟組織形態學改變的保護作用 病理學結果表明，空白對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀，肝細胞正常；模型對照組肝臟可見肝小葉結構明顯紊亂，肝束排列不齊，肝竇明顯狹窄，彌漫性炎癥細胞浸潤、灶性壞死、大片狀出血壞死等改變；ICAB各劑量組小鼠肝組織病理改變均不同程度好轉，結果見圖2。

2.3ICAB 對小鼠肝組織MDA和GSH含量及SOD、GSH-Px活性的影響 見表1。與空白對照組比較，模型對照組小鼠肝組織MDA水平明顯增高，SOD和GSH-Px活性以及GSH含量明顯降低，提示ATO可顯著影響小鼠肝細胞抗氧化能力；與模型對照組比較，ICAB中和大劑量組肝組織MDA水平顯著降低，肝組織SOD和GSH-Px活性顯著升高，肝組織GSH含量顯著提高(表1)。

2.4ICAB對小鼠肝臟Nrf2蛋白表達及核轉位的影響 Nrf2 蛋白表達測定結果顯示，空白對照組小鼠肝組織總Nrf2、細胞核內Nrf2 表達均較低，模型對照組小鼠肝細胞總Nrf2、細胞核內Nrf2表達有上升趨勢，但與空白對照組比較，差異無統計學意義。不同劑量ICAB均可顯著提高Nrf2 核轉位，也可顯著增加肝細胞內總Nrf2 表達(圖3)。

2.5ICAB對小鼠肝臟HO-1、NQO1、GCLC mRNA表達水平的影響 PCR模型對照組HO-1、NQO1、GCLC表達水平與正常對照組比較，差異無統計學意義；ICAB可劑量依賴性上調HO-1、NQO1、GCLC的mRNA表達水平，差異有統計學意義(圖4)。

3 討論

ATO是一種具有良好降血脂效果的藥物，但近年來ATO肝毒性不良反應引起廣泛關注[9]。此外，針對13 749例患者的臨床研究結果顯示，6093，2542，1983和3131例患者分別服用劑量為10，20，40 和80 mg·d-1ATO后，轉氨酶異常升高發生率分別為0.13%，0.12%，0.4%和0.89%，提示ATO所致轉氨酶升高具有劑量依賴性[10]。

中醫藥在清熱解毒、保肝護肝方面有豐富的理論與實踐經驗。金銀花具有治療濕熱黃疸、細菌感染等作用，可用于解熱抗炎、降脂、利膽保肝[11]。ICAB是從金銀花中提取的多酚類化合物，具有抗氧化、保肝和抗神經退行性疾病等生物活性[12-13]。本研究發現，ICAB可以逆轉ATO所致小鼠血清ALT和AST含量升高。組織病理結果表明，ICAB還可以改善ATO所致肝細胞壞死性改變。

圖2 5組小鼠肝組織病理特征(HE，×20)

表1 5組小鼠肝組織GSH、MDA 水平和SOD、 GSH-Px活性測定結果

組別肝臟GSH/(mg·g-1)肝臟MDA/(nmol·mg-1)肝臟SOD活性肝臟GSH-Px活性(U·mg-1)空白對照組2.52±0.710.59±0.17633.58±159.21394.81±125.81模型對照組1.52±0.52 ①0.85±0.15①389.44±154.70①266.85±98.74①ICAB 小劑量組1.75±0.290.79±0.10431.58±99.19287.96±88.28 中劑量組2.13±0.34②0.66±0.17③479.46±157.51②375.25±92.28② 大劑量組2.97±0.50③0.62±0.23③690.43±174.07③395.01±95.74③

①與空白對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05；③與模型對照組比較，P<0.01。

①Compared with blank control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.05；③compared with model control group，P<0.01.

A.肝臟Nrf2免疫熒光(比例尺=50 μm)；B.Nrf2熒光強度；C.細胞核Nrf2表達；D.總Nrf2表達；a.空白對照組；b.模型對照組；c.ICAB小劑量組；d.ICAB中劑量組；e.ICAB大劑量組；①與模型對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05。

A.fluorescence staining of Nrf2 in the liver (scale bar=50 μm)；B.fluorescence intensity of Nrf2；C.nuclear expression of Nrf2；D.total expression of Nrf2；a.blank control group；b.model control group；c.low-dose ICAB group；d.median-dose ICAB group；e.high-dose ICAB group；①Compared with model control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.05.

A.空白對照組；b.模型對照組；c.ICAB小劑量組；d.ICAB中劑量組；e.ICAB大劑量組；①與模型對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.01。

A.blank control group；b.model control group；c.low-dose ICAB group；d.median-dose ICAB group；e.high-dose ICAB group；①Compared with model control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.01.

Nrf2是亮氨酸拉鏈家族中調節氧化應激反應的重要轉錄因子。正常生理狀態下，Nrf2通過N端與kelch樣ECH聯合蛋白1(kelch-like ECH associated protein 1，Keap1)特異性結合于細胞質，此時Nrf2活性受到抑制，細胞內抗氧化物處于基礎表達水平，抗氧化物酶未被誘導。遭受氧化損傷時，Nrf2與Keap1偶聯解離，Nrf2轉位入核，識別并結合ARE，促進下游抗氧化相關基因的轉錄[14-15]。Nrf2-ARE通路是迄今為止發現的最重要的內源性抗氧化應激通路，使機體和細胞抵御活性氧和有毒物質的侵害。本研究結果顯示，模型對照組小鼠單獨給予ATO也可輕微提高Nrf2核轉位，這可能是肝細胞對外界刺激作出的防御性應激反應。而ICAB可顯著上調Nrf2表達并促進其核轉位。Nrf2入核轉位后，與ARE 結合啟動下游HO-1、NQO1、GCLC基因表達，發揮抗氧化作用。

綜上所述，ICAB 對ATO誘導的藥物性肝損傷具有一定的保護作用，其機制可能與促進Nrf2入核，增強肝組織中HO-1、NQO1和GCLC表達，抑制氧化應激相關。