超高效液相色譜結合親水相互作用色譜法測定注射液中普魯卡因和青霉素的含量

吳劍平，姜芹，王博，嚴鳳，張文剛，黃士新

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

普魯卡因青霉素，其化學名為對氨基苯甲酰基2-(二乙氨基)乙酯(6R)-6-(2-苯基乙酰氨基)-青霉烷酸鹽一水合物[1]，分子式為：C13H20N2O2·C16H18N2O4S·H2O，CAS No：54-35-3。其屬于內酰胺類抗生素，是在青霉素G 的基礎上研制出來的下一代長效青霉素，其克服了青霉素G 作用時間短的缺點，主要用于革蘭氏陽性菌感染，亦用于放線菌及鉤端螺旋體等感染。在獸醫臨床領域，普魯卡因青霉素作為使用最廣泛的治療乳牛乳腺炎、陰道炎和其他疾病的抗生素，獲得了良好的療效[2-3]。目前《中國獸藥典》二一五年版一部、《美國藥典》USP36-NF31及《英國藥典》2013年版獸藥卷收載了該產品[4-6]。根據獸藥典辦[2012]9號文件，按中國獸藥典辦的任務要求，曾于2015年對擬收載于《中國獸藥典》二一五年版一部的普魯卡因青霉素注射液進行了質量標準復核工作，對其中有關該產品各項目技術指標及檢測方法進行了驗證，并作了進一步的修訂[7]。隨著檢測技術的進步，超高效液相色譜(UPLC)正日益普及，其相比于傳統液相色譜具有分離效率高，分析速度快，溶劑消耗小等優點[8-11]。親水相互作用色譜(HILIC)在分析極性化合物時比傳統反相色譜更高的保留能力，可運用在強極性化合物的色譜分析中[12-15]。在實際檢測普魯卡因青霉素注射液過程中發現一些問題有待解決：①由于其劑型為無菌油混懸液，對含量測定項下的精密量取一定體積較為不便； ②普魯卡因和青霉素為強極性化合物，兩者保留差異較大導致單針分析時間過長；③由于普魯卡因方法所使用流動相中含有高比例鹽和離子對試劑，對色譜柱損害較大。上述這些問題可以通過UPLC結合HILIC方法解決。

1 材料和方法

1.1 儀器 UPLC H-Class超高效液相色譜、Empower2控制軟件、eλ-PDA紫外二極管陣列檢測器等(Waters, 美國)、高速冷凍離心機(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER)；電子天平(AL204，梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 材料、藥品與試劑 青霉素對照品(中國獸醫藥品監察所，批號：K0251509，93.6%)，普魯卡因對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100424-201102，99.8%)，普魯卡因青霉素注射液(某獸藥生產企業，規格：10 mL：300萬單位，批號：190902-1，190902-2，190902-3，190902-4，190902-5)甲酸銨(分析純)，甲酸、乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、石油醚(色譜純)；去離子水(電阻率≥18 MΩ·cm)。

1.3 色譜條件色譜柱 HILIC分析柱(Thermo AccucoreHILIC100×2.1mm，2.6 μm)，柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL/min,進樣量：5μL，流動相：A為0.05 mol/L甲酸銨(用甲酸調節pH=4.00)，B為乙腈，A∶B=10∶90等度洗脫，紫外二極管陣列檢測器測試235 nm波長處吸收。

1.4 前處理條件精密量取 1.00 mL樣品置于150 mL分液漏斗中，另準備10 mL石油醚將移液管上掛壁液體全部清洗轉移至該分液漏斗，加入10 mL甲醇，充分震搖1 min，靜置分層后收集下層液于50 mL容量瓶中。再次加入10 mL甲醇重復上述操作，將下層液體合并于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度并搖勻。精密量取5.00 mL瓶中溶液置100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻后吸取適量過0.22 μm尼龍濾膜后裝入棕色進樣瓶上機測定。

2 結果與分析

2.1 色譜系統適用性結果 取含青霉素 160 μg/mL、普魯卡因200 μg/mL的標準品溶液5 μL上機測定235 nm波長處吸收，所獲色譜圖如圖1所示，其系統適應性參數如下表1所示。實驗結果表明，該色譜條件下青霉素與普魯卡因均能滿足中國獸藥典2015年版一部通則0512高效液相色譜法系統適用性試驗下相應要求。

表1 色譜系統適用性試驗結果Tab 1 Results of the chromatographic system suitability test

(a) 對照品 Standard；(b)樣品 Sample圖1 超高效液相色譜圖Fig 1 Chromatography by UPLC

2.2 線性定量范圍 取青霉素和普魯卡因對照品適量，用流動相溶解并稀釋至每1 mL中分別含青霉素1600 μg/mL和普魯卡因2160 μg/mL的標準品中間溶液，用流動相稀釋至含青霉素40、80、160、400、800 μg/mL標準工作曲線溶液，其中含普魯卡因分別為 54、108、216、540、1080 μg/mL。按1.3項色譜條件進樣檢測，將所得色譜圖積分面積以Y表示，進樣濃度以X表示，所得回歸曲線如下表2所示，其線性相關系數r都大于0.999。實驗結果表明，該方法在供試品青霉素含量40～800 mg/mL，普魯卡因含量50～1000 mg/mL內線性關系良好(表2)。

表2 普魯卡因青霉素標準曲線Tab 2 Standard curve of procaine benzylpenicillin

2.3 方法準確度與精密度 精密量取取供試樣品20份，其中5份作為本底樣品直接按1.3項和1.4項方法進行檢測獲得樣品的本底含量，剩余15份分成3批，每一批為一個添加含量水平，進行添加回收實驗，其中一批添加青霉素128 mg，普魯卡因86.4 mg；其中一批添加青霉素160 mg，普魯卡因108 mg；剩余一批添加青霉素192 mg，普魯卡因 129.6 mg,取5批樣品進行上述實驗。分別按1.3項和1.4項實驗條件進行檢測后將結果扣除本底中的青霉素與普魯卡因含量后計算回收率，所得結果如表3所示。實驗結果表明，其添加回收率在92%～105%，RSD<3%，滿足中國獸藥典2015年版一部通則9101獸藥質量標準分析方法驗證指導原則中準確度與精密度項下相關要求。

表3 方法準確度與精密度Tab 3 Accuracy and precision of the method

2.4 溶解液與提取液的比較試驗結果 嘗試了多種不同極性溶解溶液，包括純乙腈、乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、正己烷和石油醚溶解樣品。分別精密量取1.00 mL樣品，以上述溶解液清洗移液管并轉移至分液漏斗中，分別添加青霉素160 mg，普魯卡因108 mg，之后采用1.4項中前處理條件進行凈化，測得結果如表4。比較了水、甲醇、乙腈、異丙醇的提取效率分別以上述4種提取液分次提取后稀釋定容，上機測定，測得結果如表5。實驗結果表明，石油醚在進行溶解和轉移樣品時具有更好的溶解性且回收率最高，因此，選擇石油醚來溶解、轉移樣品和除去助劑；甲醇在進行提取時回收率最高，因此，選擇甲醇作為提取劑。

2.5 與原藥典方法比較結果 以市售某公司實際生產的普魯卡因青霉素注射液產品(規格：10 mL：300萬單位，批號：190902-1，190902-2，190902-3，190902-4，190902-5)為樣品，分別使用本方法與《中國獸藥典2015版一部》普魯卡因青霉素注射液含量測定項下方法進行5次重復檢測后進行比較，結果如表6所示，兩種方法所獲結果的RSD<3%，符合9101獸藥質量標準分析方法驗證指導原則，結果一致。

表4 溶解液比較Tab 4 Comparison of the solution

表5 提取劑比較Tab 5 Comparison of the extract

表6 方法比較(n=5)Tab 6 Comparison of the methods (n=5)

3 討論與結論

3.1 溶解液與提取液的優化過程 由于普魯卡因青霉素注射液為無菌油混懸液，其在常溫下粘度較高，移液管上的油液不易完全被轉移，原方法用稱取一定重量后測算比重，最后換算成體積的方式進行，該方式需要用到大量樣品溶液，且由于液體黏度大比重瓶不易清洗。通過查閱相關資料可知[5-6]，普魯卡因(LogP=2.10)和青霉素(LogP=1.46)屬于極性較大的化合物，在極性較小的溶解液中幾乎不溶，而在極性較大的有機試劑中溶解性很好，故本方法擬用足量弱極性溶劑充分溶解油液并將移液管上的油液完全清洗轉移至分液漏斗中，再用強極性提取液充分提取其中的普魯卡因青霉素后稀釋定容來解決前述問題。本研究嘗試了多種不同極性溶解溶液，包括純乙腈、乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、正己烷和石油醚溶解樣品，獲得了2.4項中實驗結果，證明石油醚在進行溶解和轉移樣品時具有更好的溶解性且回收率最高，因此選擇石油醚來溶解、轉移樣品和除去助劑。而普魯卡因和青霉素因極性較大，需用強極性溶劑提取后進行測定，比較了水、甲醇、乙腈、異丙醇的提取效率，獲得了2.4項中實驗結果，證明甲醇在進行提取時回收率最高，因此，選擇甲醇作為提取劑。

3.2 親水相互作用色譜法在分析普魯卡因和青霉素時的優勢 親水相互作用色譜(HILIC)的保留機制比較復雜，主要有分配機制和吸附機制(包括氫鍵作用、偶極間作用等)，還涉及靜電作用和離子交換等。普魯卡因(LogP=2.10)和青霉素(LogP=1.46)都屬于極性較大的化合物，在反相色譜柱上難以保留，因此，原藥典方法選擇氫氧化四丁基銨作為離子對試劑以加強對目標化合物的保留，但使用離子對試劑對色譜柱的使用壽命和方法的耐用性具有負面影響，且不可作為液質聯用檢測使用的流動相，不利于方法的拓展。因此，在建立新方法時考慮到這些因素改用HILIC方法，對普魯卡因和青霉素都具有良好的保留，色譜系統適應性參數也符合藥典相應要求[4]。另外，HILIC法進樣溶劑一般為高比例有機試劑，這和樣品前處理中溶解液、提取液和稀釋液性質更接近，不必像反相色譜那樣再做溶劑置換，這降低了操作中引入的誤差，有利于方法的精密度。

本研究建立了UPLC結合HILIC法測定注射液中普魯卡因和青霉素含量的方法。精密量取樣品，以石油醚充分洗滌轉移和溶解樣品，以甲醇提取后經乙腈稀釋后進樣測定。實驗結果表明，該方法在定量范圍內線性關系良好(r>0.999)，其添加回收率在92%～105%，RSD<3%，表明該方法具有較好的準確度與精密度。通過與《中國獸藥典2015版一部》普魯卡因青霉素注射液含量測定項下方法所測得結果的比較，結果一致。