博落回中四種生物堿的薄層鑒別研究

陳燕樂，楊廣民，唐昭山，2，曾建國

(1.湖南美可達生物資源股份有限公司，長沙 410331；2.湖南省中藥提取工程研究中心，長沙410329； 3.湖南農業大學湖南省中獸藥重點實驗室，長沙410128；4.湖南省獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，長沙410128)

博落回是一種以生物堿為主要活性成分的民間傳統中藥，具有散瘀、祛風、解毒、止痛及殺蟲等功效[1]。該植物為罌粟科博落回屬的多年生草本植物，全屬共兩種，包括博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br. 與小果博落回(Macleayamicrocarpa(Maxim.)Fedde)，以博落回應用為主，但小果博落回也作博落回使用[1～2]。博落回中的主要生物堿為原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿這四種生物堿，富集于博落回的果莢和葉片中。博落回散和博落回注射液都是以博落回果莢為原料進行開發的新獸藥，其它藥用部位現在也在進行系列產品開發。目前應用液相方法檢測生物堿在博落回各個部位中的含量報道很多[3～6]，未見報道相關的薄層方法定性鑒別，但在博落回藥材質量檢測中薄層鑒定也有很重要的意義，故對博落回各個部位中四種生物堿進行薄層鑒別研究。

1 材 料

1.1 儀器 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(梅托勒-托利儀器(上海)有限公司)；紫外三用儀(杭州齊威儀器有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)；微量點樣管；玻璃噴霧瓶；雙槽玻璃展開缸。

1.2 試劑與藥品 原阿片堿(110853-201805)，血根堿(510001-201101)，白屈菜紅堿(111718-201402)均購自中國藥品檢驗研究院；別隱品堿(170501，湖南美可達生物資源股份有限公司自制)；甲醇、鹽酸、二甲苯、氯仿、環已烷、丙酮、氨水和碘化鉍鉀均為分析純試劑。博落回果、博落回葉、小果博落回果及小果博落回葉均來自湖南美可達生物資源股份有限公司采購，由湖南中醫藥大學楊廣民教授分別鑒定來源于博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br. 與小果博落回(Macleayamicrocarpa(Maxim.)Fedde)。

2 方法與結果

2.1 博落回供試品溶液

2.1.1 博落回果供試品溶液 取博落回果粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)10 mL，超聲處理1 h，濾過，濾液作為供試品溶液。

2.1.2 博落回葉供試品溶液 取博落回葉粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)25 mL，超聲處理1 h，濾過，濾液作為供試品溶液。

2.1.3 小果博落回果供試品溶液 取小果博落回果粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)25 mL，超聲處理1 h，濾過，濾液作為供試品溶液。

2.1.4 小果博落回葉供試品溶液 取小果博落回葉粉末1 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)10 mL，超聲處理1 h，濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液 分別取原阿片堿，別隱品堿，血根堿和白屈菜紅堿對照品，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)制成每1 mL分別含原阿片堿1 mg,別隱品堿1 mg，血根堿1 mg和白屈菜紅堿1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 實驗結果

2.3.1 二甲苯-甲醇 照薄層色譜法(附錄0502)試驗，吸取上述4種生物堿對照品溶液，各樣品供試品溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯-甲醇(5 ∶1)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，立即展開，取出，晾干。在可見光下(圖1)，原阿片堿和別隱品堿不顯色，血根堿和白屈菜紅堿分別顯紅色和黃色，博落回果和小果博落回葉供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應位置顯相同顏色的斑點；在254 nm熒光下(圖2),原阿片堿和別隱品堿無熒光，博落回果和小果博落回葉供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應位置顯明顯的相同顏色的熒光斑點，博落回葉和小果博落回果供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應位置顯較弱的熒光斑點；噴碘化鉍鉀試液后(圖3),博落回果供試品溶液在和原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿對照品相應位置上顯相同顏色的斑點，博落回葉供試品溶液在和原阿片堿、別隱品堿相應位置上顯相同顏色的斑點，小果博落回果供試品溶液在和別隱品堿對照品相應位置上顯相同顏色的斑點，小果博落回葉供試品溶液在和血根堿、白屈菜紅堿和別隱品堿對照品相應位置上顯相同顏色的斑點。

圖1 博落回TLC圖譜(日光下)Fig 1 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M.microcarpa(sunlight)

圖2 博落回TLC圖譜(254 nm熒光)Fig 2 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M.microcarpa(UV254nm)

圖3 博落回TLC圖譜(碘化鉍鉀試液顯色)Fig 3 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M.microcarpa (react with Iodized bismuth potassium solution)

2.3.2 環已烷-丙酮 照薄層色譜法(附錄0502)試驗，吸取上述原阿片堿和別隱品堿對照品溶液，各樣品供試品溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環已烷-丙酮(3∶2)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，立即展開，取出，晾干，噴碘化鉍鉀試液后(圖4),博落回果和博落回葉供試品溶液在原阿片堿和別隱品堿對照品相應位置上顯相同顏色的斑點，小果博落回果和小果博落回葉供試品溶液在別隱品堿相應位置上顯相同顏色的斑點。

圖4 博落回TLC圖譜(碘化鉍鉀試液顯色)Fig 4 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M.microcarpa (react with Iodized bismuth potassium solution)

2.3.3 氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(50∶10∶1∶0.1) 照薄層色譜法(附錄0502)試驗，吸取上述4種生物堿對照品溶液，各樣品供試品溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(50∶10∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，在可見光下(圖5)，原阿片堿和別隱品堿不顯色，血根堿和白屈菜紅堿分別顯紅色和黃色，博落回果和小果博落回葉供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應位置顯相同顏色的斑點；在254 nm熒光下(圖6),原阿片堿和別隱品堿無熒光，博落回果和小果博落回葉供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應位置顯明顯的相同顏色的熒光斑點，博落回葉和小果博落回果供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應位置顯較弱的熒光斑點；噴碘化鉍鉀試液后(圖7),博落回果和小果博落回葉供試品溶液在和血根堿、白屈菜紅堿對照品相應位置上顯相同顏色的斑點，原阿片堿對照品展開很小的距離，別隱品堿對照品基本上不展開，博落回果、博落回葉和小果博落回葉供試品溶液在和原阿片堿對應位置上顯相同顏色的斑點。

圖5 博落回TLC圖譜(可見光)Fig5 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M. microcarpa(sunlight)

圖6 博落回TLC圖譜(254 nm)Fig6 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M. microcarpa(UV254nm)

圖7 博落回TLC圖譜(碘化鉍鉀試液顯色)Fig7 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M.microcarpa (react with Iodized bismuth potassium solution)

3 討論與結論

3.1 討論

博落回中的四種生物堿在各個部位都有分布，但是含量相差較大。博落回果中以血根堿和白屈菜紅堿為主，博落回葉中以原阿片堿和別隱品堿為主，小果博落回果中以別隱品堿為主，而小果博落回葉中以血根堿和白屈菜紅堿為主，故薄層定性鑒別以主要成份為鑒別特征。

原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿這種四種生物堿遇碘化鉍鉀試液顯紅色。血根堿和白屈菜紅堿這兩種生物堿在可見光下分別顯紅色和黃色，在254 nm紫外光下有熒光，但是原阿片堿和別隱品堿在可見光下沒有顏色，紫外光下也沒有熒光，故以碘化鉍鉀試液顯色為好。

氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(50 ∶10 ∶1 ∶0.1)系統能較好的分離血根堿和白屈菜紅堿。環己烷-丙酮(3 ∶2)能較好的分離原阿片堿和別隱品堿；二甲苯-甲醇(5 ∶1)能較好的分離四種生物堿，但是血根堿和白屈菜紅堿分離不算特別好，原阿片堿和別隱品堿的比移值(Rf)比較小。

獸藥國家標準收載的博落回注射液質量標準[7]中，使用氯仿-甲醇-氨水(60 ∶1 ∶0.1)系統，博落回總堿作為對照，展距為5 cm。我們經過液相和薄層鑒別，博落回總堿中主要含有血根堿和白屈菜紅堿，該系統能對血根堿和白屈菜紅堿進行較好的分離，但是斑點有拖尾，我們在該展開劑的基礎上增加二甲苯能有效降低拖尾現像。

湖南省地標《博落回葉》[8]薄層中曾使用環己烷-丙酮(2 ∶1)分離鑒定原阿片堿和別隱品堿，該標準由本單位研究申報，在后續的研究中發現樣品溶液不用經過萃取也能較好的鑒別出生物堿成份。經過后期的研究，對博落回葉薄層條件進行了簡化和優化。

3.2 實驗結論

3.2.1 博落回果薄層鑒定條件 取本品粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)10 mL，超聲處理1 小時，濾過，濾液作為供試品溶液。另取血根堿鹽酸鹽和白屈菜紅堿對照品，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)制成每1 mL各含血根堿1 mg和白屈菜紅堿1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄0502)試驗，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(50 ∶10 ∶1 ∶0.1)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，立即展開，取出，晾干，噴碘化鉍鉀試液顯色，供試色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。

3.2.2 博落回葉薄層鑒定 取本品粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)25 mL，超聲處理1 h，濾過作為供試品溶液。取原阿片堿和別隱品堿對照品，加甲醇制成每1 mL各含原阿片堿 1 mg和別隱品堿1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄0502)試驗，吸取上述三種溶液各2 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-丙酮(2 ∶1)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，展開，取出，晾干，噴碘化鉍鉀試液顯色，供試色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色斑點。

3.2.3 小果博落回果薄層鑒定 取本品粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)25 mL，超聲處理60 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取別隱品堿對照品，加甲醇制成1 mL約含0.4 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄0502)試驗，吸取上述兩種溶液各 3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-丙酮(3 ∶2)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，展開，取出，晾干，噴碘化鉍鉀試液顯色，供試色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色斑點。

3.2.4 小果博落回葉薄層鑒定 取本品粉末約1 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)10 mL，超聲處理60 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取血根堿鹽酸鹽和白屈菜紅堿對照品，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)分別制成每1 mL含血根堿1 mg和白屈菜紅堿1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄0502)試驗，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(50 ∶10 ∶1 ∶0.1)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，立即展開，取出，晾干，噴碘化鉍鉀試液顯色，供試色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。