蒲公英提取物聯(lián)合多種抗生素對奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的體外協(xié)同抑菌實驗

魏秀麗，李晴，徐恩民，張秀英，楊志昆，張志賓，李有志*

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風險評估重點實驗室， 動物源細菌耐藥性監(jiān)測與精準化用藥山東省工程實驗室，山東省動物用中藥制劑工程實驗室，濟南250022； 2.日照市莒縣畜牧獸醫(yī)局，莒縣276500； 3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081；4.河北冀中藥業(yè)有限公司，石家莊071500)

抗生素是目前我國畜牧業(yè)中使用最廣泛和最重要的抗感染藥物,在控制畜禽的傳染性疾病和提高畜禽的生產(chǎn)性能方面發(fā)揮了巨大的作用.抗生素一方面具備重要的醫(yī)用價值,另一方面如獸用抗生素使用不當,出現(xiàn)濫用現(xiàn)象,會給禽畜個體及畜牧產(chǎn)業(yè)帶來眾多問題[1].蒲公英為菊科植物蒲公英、堿地蒲公英或同屬數(shù)種植物的干燥全草。味甘、微苦，性寒，無毒，用于疔瘡腫毒、乳癰、咽痛、濕熱黃疸、熱淋澀痛，藥材及相關(guān)制劑被收錄于中華人民共和國藥典和獸藥典[2-4]。由于其良好的治療效果和經(jīng)濟性，蒲公英提取物在獸藥中的研究也成為焦點，但據(jù)文獻報道不同來源產(chǎn)地的蒲公英其有效成分差異很大，其中以咖啡酸、菊苣酸、單咖啡酰酒石酸等為代表成分，進行液相色譜含量測定，進行定量控制成為必然[5-8]。

奶牛乳房炎是奶牛常見多發(fā)病,也是對奶牛生產(chǎn)危害性最大的一種疾病.據(jù)報道,臨床乳房炎占奶牛總發(fā)病率的19%～21%,在閩南農(nóng)村以個體散戶分散飼養(yǎng)為主的奶牛發(fā)病率達23%～26%,獸醫(yī)臨床中奶牛隱性乳房炎難以發(fā)現(xiàn),更難治療,特別是治療過程中由于使用抗生素和化學藥品,在牛奶中形成藥殘,直接威脅人類健康安全,所以,尋求一種安全、高效、方便、廉價而又無藥殘的藥物,已成為當務之急。隨著臨床奶牛乳房炎治療應用乳房注入劑的增多，會呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，采用浦公英配合治療奶牛乳房炎，取得良好的效果，關(guān)于蒲公英治療奶牛乳房炎的報道也日漸增多[9-10]。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 耐藥性金黃色葡萄球菌(金Z、金4、金5、金C、金L、金6、金F、金I、金2、金D)及其質(zhì)控菌ATCC18036由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.2 主要儀器 分析天平(感量0.00001g)； Waters 2695超高效液相色譜儀；布蘭德移液器(10 μL、200 μL、1000 μL)；8道布蘭德電動移液器(30-300 μL)；動物源細菌耐藥性藥敏檢測板(上海佰星生物技術(shù)有限公司)；培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；高壓滅菌鍋(日本 CL-32L)；超凈工作臺(蘇州凈化)；麥氏比濁儀(法國梅里埃)。

1.3 藥品及試劑 菊苣酸對照品(批號111752-200902)；咖啡酸對照品(批號110885-201703)；

單咖啡酰酒石酸對照品(批號18101022)；

蒲公英提取物(北京生泰爾科技股份有限公司小試產(chǎn)品、河北冀中藥業(yè)有限公司小試產(chǎn)品、東北大興安嶺格林格貝寒帶生物科技股份有限公司小試產(chǎn)品)。

抗菌藥物原料(阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟、利福昔明、硫酸慶大霉素、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考)為國內(nèi)獸藥企業(yè)提供。

金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、LB瓊脂、MH肉湯，均購自北京路橋公司。

1.4 高效液相色譜儀測定蒲公英提取物主要成分及含量

1.4.1 液相色譜測定用中藥提取物的配制 稱取三種來源的蒲公英提取物溶解并定容于10 mL 50%的甲醇中過濾，終濃度為1 mg/mL；

1.4.2 液相色譜條件 色譜柱：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相A：水(0.4%磷酸)；流動相B：乙腈，進行梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃，進樣室溫度10 ℃。二極管陣列檢測器，檢測波長為330 nm。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition table

1.5 多種抗生素對金黃色葡萄球菌的MIC值測定

1.5.1 藥敏試驗藥物的配制 將所需抗菌藥物按照試驗需要配制成適當濃度的儲備液，所有藥物儲備液過濾除菌，-20 ℃保存。

1.5.2 菌液的制備 將培養(yǎng)好的菌落，用滅菌肉湯稀釋至0.5麥氏單位。取適量菌液用滅菌肉湯培養(yǎng)基進行100倍稀釋，菌懸液濃度約為1.5*106CFU/mL,備用。

1.5.3 金黃色葡萄球菌MIC測定 采用微量肉湯稀釋法進行測定[11]。

1.6 棋盤法聯(lián)合藥敏試驗 選取金黃色葡萄球菌金4作為后續(xù)聯(lián)合用藥試驗菌株。

(1)將各種藥物原液按512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL標準，用MHB營養(yǎng)肉湯依次倍比稀釋梯度。

(2)取出滅菌的96孔板，采用棋盤法，在96 孔板的橫列和縱列中將不同濃度的2 種藥物加入50μL，不同濃度組合的2種藥物混合液置于各孔中。

(3)在加藥的96孔板的每個孔里加入100 μL稀釋好的106CFU/mL金黃色葡萄球菌懸液，然后放入37 ℃溫箱中，12～14 h后觀察結(jié)果，用肉眼觀察每個孔的渾濁度，計算統(tǒng)計聯(lián)合用藥的效果。

(4)重復三次棋盤試驗[12]。

1.7 計算部分抑菌濃度指數(shù)FIC 聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果濃度(Fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)IC)指數(shù)作為聯(lián)合藥敏試驗的判斷依據(jù)，計算公式如下：

其中FIC ≤ 0.5為“協(xié)同作用”；0.5

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源蒲公英提取物的含量測定 結(jié)果，見表2，圖1-圖5。

表2 不同來源蒲公英提取物含量Tab 2 Contents of Dandelion extracts from different sources

圖1 約40 μg/mL單咖啡酰酒石酸對照品色譜圖Fig 1 Chromatogram of about 40 μg/mL mono caffeinated tartaric acid reference substance

圖2 約20 μg/mL綠原酸、咖啡酸、60 μg/mL菊苣酸對照品色譜圖Fig 2 Chromatogram of 20 μg/mL chlorogenic acid, caffeic acid and 60 μg/mL cichoric acid reference substance

圖3 蒲公英提取物(河北冀中)液相色譜圖Fig 3 HPLC of dandelion extract (Jizhong, Hebei)

圖4 蒲公英提取物(東北)液相色譜圖Fig 4 HPLC of dandelion extract (Dongbei)

圖5 蒲公英提取物(北京生泰爾)液相色譜圖Fig 5 HPLC of dandelion extract (shengtai'er of Beijing)

2.2 體外抑菌實驗MIC測定 根據(jù)蒲公英提取物成分及含量測定結(jié)果，選取河北冀中的蒲公英提取物進行體外藥敏試驗。對10株金黃色葡萄球菌的體外抑菌實驗MIC測定結(jié)果見表3。

表3 多種藥物對10株金黃色葡萄球菌體外抑菌實驗結(jié)果Tab 3 In vitro antibacterial test results of various drugs on 10 strains of Staphylococcus aureus

2.3 聯(lián)合用藥對金黃色葡萄球菌藥敏試驗聯(lián)合用藥指數(shù)(FIC)結(jié)果表

表4 聯(lián)合用藥對金黃色葡萄球菌聯(lián)合用藥指數(shù)Tab 4 FIC value of Staphylococcus aureus in combination

從表中看出，蒲公英提取物與7種藥物聯(lián)合應用，都具有很好地協(xié)同作用，能大幅度地抗菌藥的抑菌濃度，減少用藥量，給中西藥聯(lián)合應用推薦抗菌藥減量化應用提供了理論依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

獸用抗生素是目前我國畜牧業(yè)中使用最廣泛和最重要的藥物,在防控畜禽疫病和提高畜禽生產(chǎn)性能方面功不可沒,但它的不當使用,也對公共衛(wèi)生造成了極大的危害[13]。本試驗結(jié)果可以看出，不同的菌株對不同的藥物敏感性差異較大，與奶牛場的用藥習慣有關(guān)，治療奶牛隱性乳房炎，有必要提前進行藥敏試驗來科學精準的應用藥物。臨床上應用較久的阿莫西林、氨芐西林已經(jīng)出現(xiàn)了部分耐藥菌株，最為敏感的是齊魯動物保健品有限公司和齊魯晟華制藥有限公司的利福昔明和頭孢噻呋、頭孢喹肟；單硫酸卡那霉素對金黃色葡萄球菌有的極為敏感，有的非常耐藥。還有幾種藥物并未應用于臨床，其耐藥性差異較大，例如鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、硫酸慶大霉素、金霉素、氟苯尼考等。

獸藥行業(yè)大發(fā)展創(chuàng)新日新月異，不少企業(yè)或科研院所研究鹽酸頭孢噻呋乳膏劑、含蒲公英藥材提取物的中藥，來治療奶牛乳房炎[14-17]。現(xiàn)在臨床治療奶牛乳房炎的藥物用很多，有硫酸頭孢喹肟乳房注入劑、硫酸頭孢喹肟乳房注入劑、利福昔明乳房注入劑[18-22]。本試驗，可以看出，蒲公英提取物在一定程度上具有抗菌作用，與多種藥物聯(lián)合應用在體外對奶牛乳房炎的主要病原菌具有良好的協(xié)同作用，理論能在一定程度上減少抗菌藥物的使用，從而減少藥物殘留，縮短棄奶期。但，如何進行中西方的復配，如何優(yōu)化生產(chǎn)工藝是產(chǎn)品穩(wěn)定有效，臨床效果的實現(xiàn)還需要很多的探索性試驗來驗證。

另外蒲公英提取物，對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌和殺菌的作用，但體外最小抑菌濃度在78.1～625 μg/mL的范圍內(nèi)，與抗菌藥相比，是有些差的，與文獻報道的比較一致[23]，但由于中藥有對機體整體的調(diào)節(jié)作用，這種作用也不容忽視，相對于耐藥菌而言，有些菌株對蒲公英提取物反而更敏感。