去泛素化酶3在子宮肌瘤中的表達及對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響

高光玲 李楊 杜玲莉 李珍珠 蔣海霞

子宮肌瘤是女性生殖系統疾病中的常見腫瘤，是發生于子宮的良性腫瘤，通常以切除子宮作為治療手段[1]。缺失子宮不僅使患者喪失生育能力，而且有可能誘發盆底功能障礙性疾病，給患者生活造成嚴重影響。去泛素化酶3(ubiquitin-specific protease 3，USP3)屬于去泛素化酶家族成員，由520個氨基酸組成，分子質量為59 kD，可斷裂脯氨酸殘基的連接[2]。USP3具有兩個結構域：一個是泛素特異性蛋白酶活性區域，另一個為鋅指泛素連接結構域，其在腫瘤細胞增殖過程中發揮著重要的調節作用[3]。有研究表明，USP3可通過與鼠雙微基因2(mouse double minute 2，MDm2)蛋白相互作用，從而促進HepG2細胞增殖[4]。Nicassio等也證實，將人骨肉瘤U2OS細胞中USP3的表達敲低后，細胞增殖受到顯著抑制[5]。而USP3在子宮肌瘤的發生和發展過程中起著何種作用，目前鮮有報道。為探究USP3在子宮肌瘤中的表達水平及其對于子宮肌瘤細胞的增殖、凋亡的影響，本實驗檢測了子宮肌瘤組織和細胞中USP3的表達量，然后通過RNA干擾技術[6]敲低USP3表達后觀察了細胞的增殖、凋亡情況，并檢測了p53和MDm2的表達情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年4月至2018年7月于我院接受子宮肌瘤切除手術的56例患者為研究對象。年齡(30～62)歲，平均(46.39±1.81)歲；體重(40～61.5)kg，平均(55.75±4.69)kg；病程(3～18)個月，平均(11.1±4.4)個月；子宮肌瘤直徑(3～11)cm，平均(7.7±1.3)cm；手術時間(37.7±15.5)min。患者均無其他嚴重并發癥。本研究已獲我院倫理委員會批準，所有患者及其家屬知情并簽署同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：所有患者符合《婦產科學》[7]中子宮肌瘤的診斷標準，臨床表現為子宮出血、腹部包塊及壓迫癥狀、疼痛、不孕與流產及貧血等，借助超聲檢查并最終通過病理診斷進行確診。

1.2.2 排除標準：生殖道發生急性感染患者；臨床資料不完整或丟失的患者；伴有嚴重原發性疾病患者；伴有其他婦科疾病引起子宮炎癥患者。

1.3 RT-PCR檢測 所有患者術后從子宮肌瘤瘤體取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織1塊，作為觀察組樣本；從瘤體旁正常平滑肌組織中取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織1塊，作為對照組樣本。提取所有樣本RNA后，使用全式金公司的TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix(AT401-01)試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA。根據GeneBank中USP3的序列(NR_046342.1)并借助primer 5.0設計特異性引物(F：5’-TGAATGCCATCCTTCAGTCA-3’；R：5’-CTTGGCTCCTGGTGTGGTAT-3’)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。將上述cDNA作為模板，按照PCR程序進行擴增：95℃，5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃，10 min。PCR產物經核酸凝膠電泳后置于Bio-Rad凝膠成像系統(SYSTEM GelDoc XR+,1708195)中成像。使用Image J分析軟件進行灰度值分析，檢測USP3的轉錄水平。

1.4 Western blot檢測 將從武漢博士德公司購買的子宮肌瘤細胞和購自北納生物的子宮平滑肌細胞加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM細胞培養液中，置于37℃，5% CO2培養箱中培養。以3.0×105個/孔的密度接種12孔板，培養24 h后，收集細胞，進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳：濃縮膠恒壓80 V,20 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍到凝膠底部。使用Bio-Rad半干轉印槽(Trans-Blot SD,170-3940)在恒壓15 V，30 min條件下轉印至PVDV膜(生工，F019532-0010)。取下PVDF膜放入封閉液(TBST，5%脫脂奶粉，pH值7.4)中室溫孵育2 h；使用sigma公司生產的USP3一抗稀釋液(SAB1410046，1∶5 000)室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；使用全式金公司生產的HRP標記的二抗羊抗鼠IgG 稀釋液(HS201-01,1∶10 000)室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；最后根據ECL化學發光液(上海天能)使用說明，將PVDF膜置于Bio-Rad凝膠成像系統中顯影。實驗重復3次。

1.5 免疫組化法檢測 將子宮肌瘤組織及瘤體旁正常平滑肌組織分別置于4%多聚甲醛中過夜固定，石蠟包埋處理后，將標本進行4 μm厚度切片。將切片放置于多聚賴氨酸處理的蓋玻片上，經脫蠟、水化及熱抗原修復后，按照免疫組化SP試劑盒(福州市邁新生物技術開發公司，KIT-9710)的說明書進行操作。USP3一抗稀釋濃度為1∶1 000。在光學顯微鏡下觀察切片，陽性判定標準為細胞漿出現棕黃色顆粒。在400倍鏡下隨機選擇5個視野，計總細胞數和陽性細胞數，以公式：陽性細胞數/細胞總數，求出陽性細胞率。

1.6 RNA干擾 針對USP3的序列(613-635，AGCTACAGTACATACTGTTATCG)，利用在線工具siDirect version 2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)設計并合成小干擾RNA(Small interfering RNA；siRNA):5’-AUAACAGUAUGUACUGUAGCU-3’及5’-CUACAGUACAUACUGUUAUCG-3’。同時合成陰性對照siRNA：5’-UACUUAUAACGUAGCAGUAUG-3’及5’-AUGAAUAUUGCAUCGUCAUAC-3’。將子宮肌瘤細胞分為3組，其中轉染陽性siRNA的為siRNA-USP3組；轉染陰性siRNA的為siRNA-control組；轉染同體積PBS的為對照組。轉染6 h后更換培養基，繼續培養24 h后，利用Western blot方法檢測3組細胞中的USP3的表達水平。實驗重復3次。

1.7 細胞增殖及凋亡檢測 按上述RNA干擾方法獲得的3組細胞，培養48 h后，利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(GLPBOI，GK10001)檢測各組細胞的增殖情況。同時利用Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(Sigma，APOAF-20TST)檢測各組細胞在轉染后0 h,12 h,24 h,36 h和48 h的凋亡情況。

1.8 p53和MDm2表達水平檢測 收集上述3組細胞，利用Western blot方法檢測3組細胞中的USP3的表達水平。實驗重復3次。

2 結果

2.1 USP3在子宮肌瘤組織和正常子宮肌層組織中的表達水平比較 USP3在觀察組中mRNA的轉錄水平顯著高于對照組(P<0.05)；Western blot檢測的USP3在觀察組中蛋白質的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；免疫組化結果顯示，與對照組比較，觀察組中含有棕黃色染色顆粒的細胞數顯著增多(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 USP3在子宮肌瘤組織(觀察組)和正常子宮肌層組織(對照組)中的轉錄(A)及表達(B、C)水平

組別USP3USP3陽性細胞率(%)對照組0.22±0.041.30±0.2618.29觀察組0.78±0.16?2.79±0.56?88.98t值25.41018.06078.080P值<0.001<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 USP3在子宮肌瘤細胞和子宮平滑肌細胞中的表達水平比較 USP3在子宮肌瘤細胞中mRNA的轉錄水平顯著高于子宮平滑肌細胞(P<0.05)；USP3在子宮肌瘤細胞中蛋白質的表達水平顯著高于子宮平滑肌細胞(P<0.05)。見圖2，表2。

2.3 RNA干擾效果檢測 3組細胞間的USP3蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)；對照組細胞和siRNA-control組細胞間的中USP3蛋白表達無顯著差異(P>0.05)；與對照組細胞和siRNA-control組細胞相比，siRNA-USP3組細胞中內的USP3蛋白的表達受到顯著抑制(P<0.05)。見圖3，表3。

圖2 USP3在子宮肌瘤細胞和子宮平滑肌細胞中的轉錄(A)和表達(B)水平

組別USP3(轉錄)USP3(表達)子宮平滑肌細胞0.29±0.080.35±0.07子宮肌瘤細胞 1.02±0.20?1.05±0.21?t值7.5787.071P值<0.001<0.001

注：與子宮平滑肌細胞比較，*P<0.05

圖3 RNA干擾效果

表3 RNA干擾效果

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

2.4 USP3敲低對子宮肌瘤細胞增殖的影響 對照組和siRNA-control組細胞數均隨時間而增多；而siRNA-USP3組細胞數在培養12 h之后隨時間呈下降趨勢。對照組和siRNA-control組細胞數在各個時間點均無顯著差異(P>0.05)；與對照組和siRNA-control組相比，siRNA-USP3組細胞數在24 h，36 h和48 h時顯著降低(P<0.05)。見表4，圖4。

2.5 USP3敲低對子宮肌瘤細胞凋亡的影響 3組細胞隨培養時間增加，凋亡細胞均呈增長趨勢。3組細胞凋亡率在12 h之前無顯著差異(P>0.05)；在12 h之后各時間點的凋亡率差異顯著(P<0.05)；對照組細胞和siRNA-control組細胞數在各個時間點均無顯著差異(P>0.05)；與對照組和siRNA-control組相比，siRNA-USP3組的細胞凋亡比例在24 h、36 h和48 h時顯著增加(P<0.05)。見圖5,表5。

組別0h12h24h36h48h對照組 1.00±0.181.82±0.352.66±0.534.01±0.805.33±1.07siRNA-Control組1.00±0.141.74±0.332.71±0.544.27±0.855.28±1.06siRNA-USP3組 1.00±0.161.58±0.321.61±0.32?#1.55±0.31?#1.49±0.30?#F值0.0000.6718.57523.17030.860P值1.0000.5290.005<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

圖4 USP3敲低對子宮肌瘤細胞增殖的影響

2.6 USP3敲低對子宮肌瘤細胞中p53和MDm2表達的影響 3組細胞間p53和MDm2的表達均存在顯著差異(P<0.05)；兩種蛋白在對照組和siRNA-control組中的表達無差異(P>0.05)；p53在siRNA-USP3組細胞中表達顯著高于對照組和siRNA-control組(P<0.05)；MDm2在siRNA-USP3組細胞中表達顯著低于對照組和siRNA-control組(P<0.05)。見圖6，表6。

圖5 USP3敲低對子宮肌瘤細胞凋亡的影響

表5 USP3敲低對子宮肌瘤細胞凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

圖6 USP3敲低對子宮肌瘤細胞中p53(A)和MDm2(B)表達的影響

表6 USP3敲低對子宮肌瘤細胞中p53及MDm2表達的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

3 討論

李根[4]在研究USP3對肝癌細胞增殖時發現，USP3在肝癌組織和肝癌細胞中呈高水平表達，且USP3可與MDm2相互作用。此外，Fang等[8]的研究證實，USP3過表達，可誘發胃部癌變，可作為胃癌患者預后的生物學標志。在本實驗中，我們發現USP3在子宮肌瘤組織中的轉錄和表達水平遠遠高于正常平滑肌組織。而且，在子宮肌瘤細胞中同樣檢測到了較高水平的USP3蛋白的表達。這些發現與上述研究較為一致，表明USP3確實在子宮肌瘤組織和細胞中存在異常表達。

為保證正常的細胞周期，細胞可利用泛素-蛋白酶體途徑降解多余的蛋白。去泛素化酶可以水解靶蛋白上的泛素分子，阻止靶蛋白被降解，通過此途徑調控蛋白質水平，從而調控大部分生命過程[9]。然而正常細胞不受控制而異常增殖可誘發癌癥[10]。為確認USP3是否能夠影響子宮肌瘤細胞增殖、凋亡。利用RNA干擾技術將子宮肌瘤細胞中USP3敲低，我們發現細胞的增殖明顯受到抑制，細胞凋亡開始增加。這些都表明，USP3在子宮肌瘤細胞的增殖方面起著重要作用。

為進一步確認USP3促進子宮肌瘤細胞增殖機制，我們檢測了腫瘤抑制基因p53的表達情況。P53在抑制腫瘤增殖、保持基因組完整性方面起著重要作用。在靜息狀態下，p53在細胞中保持較低水平。遇到致癌應激、DNA損傷等各種應激時，p53迅速做出應答[11]。本實驗也發現，敲低USP3后，子宮肌瘤細胞中p53的表達顯著升高。可能由于USP3的高表達抑制了p53的表達并阻止其發揮功能。

此外，我們也檢測到USP3敲低的細胞中MDm2蛋白表達降低。這可能與p53的表達變化有關：由mdm2基因編碼產生的E3泛素連接酶MDm2蛋白可調控p53蛋白的降解[12,13]。MDm2與p53結合后，促進泛素分子標記p53，從而使其降解，從而誘導細胞異常增殖、癌變[14]。根據前文提到的研究推測，USP3可能通過穩定MDm2蛋白水平從而間接促進p53蛋白降解，達到促進子宮肌瘤細胞增殖的效果。

本文尚有不足之處：選取的樣本量較少，統計分析結果可能難以代表整體情況；檢測的指標數量少，以后研究中還要選取多種調節因子，多方面闡述機制；如有條件，也可以構建子宮肌瘤動物模型，便于進一步認識子宮肌瘤的發病機制。

綜上所述，USP3在子宮肌瘤中呈高表達，RNA干擾技術沉默USP3可以抑制子宮肌瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，可能與抑制MDm2活性從而促進p53表達有關。