硫酸軟骨素裂解酶產生菌的篩選及特性研究

葛雯

摘 要：分離硫酸軟骨素裂解酶產生菌及克隆其編碼基因是研究其酶學性質及最終實現低分子量硫酸軟骨素高質高效生產的重要研究基礎。本文利用透明圈法從白鰱魚魚腹中分離篩選出產硫酸軟骨素裂解酶的S6菌株，經16srRNA序列分析，初步鑒定為氣單胞菌，同時研究了該菌株的生長曲線和對抗生素的耐藥性，為后續針對S6菌株次級代謝產物的研究奠定基礎。

關鍵詞：硫酸軟骨素裂解酶;氣單胞菌S6;抗生素;抗藥性分析;生長曲線

Abstract：Solation of chondroitin sulfate lyase producing strain and cloning of its coding gene are the important research basis for studying its enzymatic properties and ultimately realizing high quality and efficient production of low molecular weight chondroitin sulfate. In this paper， S6 strain producing chondroitin sulfate lyase was isolated and screened from the belly of silver carp by transparent circle method. After 16s rRNA sequence analysis， it was preliminarily identified as Aeromonas. At the same time， the growth curve and antibiotic resistance of this strain were studied， which laid a foundation for the subsequent study of secondary metabolites of S6 strain.

Key words：Chondroitinase; Aeromonas S6; Antibiotics; Antibiotic resistance; Growth curve

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是一種分子量在20～50 ku的酸性黏多糖類生物大分子，廣泛存在于動物和人軟骨組織中[1]。其結構是由D-葡糖醛酸與2-乙酰氨基-2-脫氧-硫酸-D-半乳糖組成。硫酸軟骨素具有多種生理與藥理功能和作用，如抗動脈粥樣硬化、抗凝血活性的作用[2]，以及在關節中的潤滑和支撐功能等[3]。

研究發現，將硫酸軟骨素的分子量降低至2～10 ku時，其藥效更為明顯，對防治動脈粥樣硬化、風濕性炎癥和傷口愈合有更好的療效[4]。目前生物制藥領域，主要采用硫酸軟素裂解酶（Chondrotinase或Chondrotin sulfate lyase，ChSase）來制備低分子量的硫酸軟骨素，常采用酸水解法、離子交換法和酶解法[2]。其中，酶解法所需要的反應條件相對簡單且容易控制，較之前兩者有較高的性價比和優勢。

酶解法中，硫酸軟骨素酶的主要來自于微生物的發酵產物。比如，普通變形桿菌（Proteus vulgaris）[5]、肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum）[6]、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）等好氧細菌一直是主要的硫酸軟骨素酶來源。此外，從多型擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomi-cron）、糞便擬桿菌（Bacteroides stercoris）等厭氧細菌中也能獲得較高含量的硫酸軟骨素酶[7]。國內目前科研和醫療所需產品主要來自于國外進口，價格相對昂貴。本研究為實現國產硫酸軟骨素裂解酶生產的可能，在學習眾多國內外文獻后，從白鰱魚魚腹中分離得到一株產酶活性較高的氣單胞菌S6菌株。通過透明圈變化篩選突變株，并通過進一步研究該菌株對抗生素的耐藥性，為后續對硫酸軟骨素裂解酶編碼基因相關研究奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗以魚、海腸、扇貝、海膽、鮑魚等的內臟以及各地土樣作為篩菌樣本來源;抗生素：氨芐青霉素（Am）、卡那霉素（Km）、四環素（Tc）和氯霉素（Cl）;酶及試劑：質粒提取試劑盒購自BIOMIGA公司;各種Tag酶、Extag酶、Buffer、dNTP及其他試劑分別購自Sigma、TAKARA等公司。

1.2 培養基

①LB培養基。胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，固體培養基加入1.5%瓊脂粉，用去離子水定容至1 L，調節pH至7.0，121 ℃滅菌30 min。②BBL培養基。（BD公司提供的BactoTM Brain Heart Infusion）牛腦浸出物7.7 g（提自200 g原料），牛心浸出液9.8 g（提自250 g原料），蛋白胨10.0 g，葡萄糖2.0 g，氯化鈉5.0 g，Disodium磷酸鹽2.5 g。將上述混合物按比例取37 g溶于1L去離子水中。加熱溶化并不斷攪拌以混合均勻。在121 ℃下滅菌15 min。③BBL+培養基。BBL培養基148 mL（10.4 g BBL溶于148 mL去離子水中），5%牛血清白蛋白溶液40 mL，2%硫酸軟骨素混合物溶液12 mL，硫酸軟骨素的終濃度為1.2 mg·mL-1。

1.3 實驗方法

（1）原始菌株的采集。產硫酸軟骨素裂解酶的菌株主要是從水生生物的腸道內提取。本實驗以魚、海腸、扇貝、海膽、鮑魚等的內臟以及各地土樣作為篩菌樣本來源，將采集到的樣品裝于無菌自封袋中保存，并在實驗室的超凈工作臺上，利用平板劃線單菌落法對不同的菌落進行純化，用于后續篩選。

（2）產酶菌株的獲取。利用大分子的硫酸軟骨素與適當濃度的牛血清白蛋白混合后，與一定濃度的冰醋酸溶液可發生渾濁反應原理，而已被裂解的小分子硫酸軟骨素則不發生該反應的原理，對菌落平板進行透明圈篩選，得到目的菌株[8]。如圖1所示，用平板稀釋分離法分離后的菌株，同時平行劃短線法接種BBL平板和BBL+平板，菌落編號要對應。劃完短線的菌置于28 ℃培養箱中培養24 h后，在長出菌落的BBL+平板上覆蓋一層濃度為2 mol·L-1的冰醋酸溶液，觀察菌落周圍是否產生透明圈。如產生透明圈，在BBL平板上找到相應位置的同一菌株，液體培養后進行菌種保存。

（3）菌種鑒定。采用16srDNA PCR的方法得到所篩菌株的16srDNA基因片段，將該序列送去公司測序，可得全序列編碼，在EzTaxon網站上將測序得到的基因序列與數據庫序列進行比對，從而鑒定出所篩得菌株的種屬關系。

（4）抗生素抗性分析。①本實驗主要檢測所篩選的產酶菌株對卡那霉素、氯霉素、氨芐青霉素和四環素的抗性反應。將上述各種抗生素配制成濃縮液，過濾除菌后作為貯液備用。使用時稀釋到所需濃度，等LB培養基的溫度下降到50～60 ℃時，加入適量的抗生素溶液，制成含抗生素的LB液體培養基若干。②將受體菌株S6在固體LB培養基上活化，28 ℃培養24 h。之后，挑取單菌落接種于10 mL已滅菌的LB液體培養基中，28 ℃振蕩培養24 h后測OD600值。當OD600值為1時，按1%的接種量，將受體菌株S6接種于含有相應濃度抗生素的5 mL LB液體培養基中，于28 ℃培養72 h后，檢測其生長情況。

（5）產酶菌株生長曲線的測量。為了解產酶菌株氣單胞菌S6的生長規律，為后續試驗做好準備工作，本實驗用分光光度計進行光電比濁測定不同培養時間細菌懸浮液的OD值，繪制生長曲線：①挑取S6單菌落，接種于10 mL已滅菌的LB液體培養基中，置于28 ℃搖床振蕩培養18 h。②用移液管吸取2 mL菌懸液接入盛有100 ml LB液體培養基的三角瓶內，混合均勻后于28 ℃搖床中振蕩培養。③比濁測定：用未接種的LB液體培養基作空白對照，選用600 nm波長進行光電比濁測定。在培養后每1 h吸取3 mL菌液置于比色皿中測取吸光值。使其光密度值在0.2～0.8。④需做3次平行試驗，記錄數據并根據數據繪出氣單胞菌S6的生長曲線圖。

2 結果與分析

2.1 野生菌株篩選結果

根據大分子的硫酸軟骨素與適當濃度的牛血清白蛋白混合后，與一定濃度的冰醋酸溶液可發生渾濁反應，而已被裂解的小分子硫酸軟骨素不發生該反應的原理，對菌落平板進行透明圈篩選。從分離和培養的野生菌中，可得到產生明顯透明圈的菌株（見圖2）。實驗采用定量測量透明圈直徑與菌落直徑比值的方法來衡量野生菌產酶效率，統計測量結果見表1。

2.2 野生菌菌種鑒定結果

由透明圈和菌落直徑的比值可知，S6號菌產生硫酸軟骨素裂解酶的效率最高，從中選取S6菌株進行測序，并把得到的基因序列與EzTaxon數據庫中的菌種序列進行同源性比對，鑒定其種類，可知S6號菌屬于氣單胞菌，是從白鰱魚魚腹中分離所得。

2.3 產酶菌株S6對不同抗生素的抗性結果和分析

分別檢測S6對氨芐霉素、卡那霉素、氯霉素和四環素的抗性，結果表明：S6對氨芐霉素具有一定的抗性，對卡那霉素、四環素和氯霉素基本沒有任何抗性。具體統計結果見表2。

2.4 產酶菌株S6生長曲線的測量結果

在28 ℃搖床中培養已分離純化得到的S6菌株，每隔1 h吸取一定量的發酵菌液稀釋至所需濃度，使用分光光度計在600 nm波長光線下，進行光電比濁測定不同培養時間細菌懸浮液的OD值。注意稀釋后菌液的OD值要位于0.2～0.8。根據稀釋倍數換算后得數據表格，繪制氣單胞菌S6的生長曲線如圖3。由圖3知，菌株在生長2～10 h為對數生長階段，在生長10 h之后進入穩定期。

3 討論與結論

本實驗通過從魚、海腸、扇貝、海膽、鮑魚等的內臟以及各地土樣中篩選，分離得到一株產硫酸軟骨素裂解酶菌株S6，經鑒定確定為一種氣單胞菌。通過抗生素抗性分析可知，該產酶菌株對卡那霉素、四環素和氯霉素幾乎沒有抗性，是利用Tn5轉座子質粒插入進行基因郵編的良好目的菌株。另外，通過對產酶菌株S6長曲線的測定，可知該菌株在生長2～10 h為對數生長階段，在生長10 h之后進入穩定期，為后續針對S6菌株次級代謝產物的研究做好了準備工作。

參考文獻：

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[6]Gu K F，Linhard R J，Laliberte M，et al.Purication，Characterization and Speficity of Chondroitin Lyases and Glycuronidase From Flavobacterium Heparinum[J].Biochem Journal，1995，133：383-386.

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[8]Kenan G U，Robert J.Purification，characterization and specificity of chondroitin lyases and glycuronidase from Flavobacterium heparinum[J].Biochemical，1995，312，569-577.