海帶配子體保存過程中污染菌的分離純化及藥敏試驗

武瑞娜，王娜，羅世菊，李曉婕

（山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術研究中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術重點實驗室，山東 煙臺264003）

海帶配子體是海帶種質資源的重要保存形式，海帶配子體在生長過程中常會受到細菌、真菌、等病原生物的危害，導致配子體發病死亡。海帶的雌配子體和雄配子體發病情況相類似，在顯微鏡下觀察，配子體在發病初期，細胞壁變厚變黑，色素體聚集顏色變暗，生長速度減慢甚至不再生長，之后產生質壁分離，最后色素全部分解，只剩細胞壁空殼，從而導致配子體最后死亡[1]，因此防控細菌、真菌污染是海帶配子體克隆保存過程中需要解決的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料：該實驗室保存過程中發生污染的海帶配子體克隆。

固體培養基：液體增菌培養基，營養瓊脂培養基，馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂（PDA）培養基由該實驗室自行配制。

藥敏紙片：大部分由微生物試劑公司提供，個別如先鋒霉素藥敏紙片由研究室自制。

試劑：PCR試劑購于上海生工，PCR產物測序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 將污染的海帶配子體及培養液，在固體培養基上三區劃線，進行培養，然后挑出單個菌落，最后獲得純培養。

1.2.2 DNA提取 取純培養的細菌和真菌接種于液體培養基中過夜培養，收集細菌和真菌。細菌DNA提取采用SDS法，真菌采用CTAB法。提取的DNA加入100μL的雙蒸水溶解，-20℃保存。用核酸蛋白濃度測定儀測定DNA的濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。

1.2.3 PCR反應 細菌PCR選用16s rDNA通用引物27F與1492R（由上海捷瑞公司合成），引物序列如下：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。PCR反應體系（50μL）：10×PCR buffer 5μL，25 mM MgCl23μL，d NTP 1μL，上下游引物各1μL，2.5 U的TaqDNA polymerase（上海生工公司）0.5μL，DNA模板0.5μL，雙蒸水38μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，54.5℃退火1 min，72℃延伸1 min（30個循環）；72℃最后延伸10 min。

真菌PCR擴增ITS片段，選用通用引物ITS1與ITS4(由上海捷瑞公司合成)，引物序列如下：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3’。PCR反應體系（25 ul）：10×PCR bufer 2.5μL，25 mM MgCl22μL，d NTP 0.5μL，引物1TS1與ITS4各0.5 L，2.5 u的Taq DNA polymerase（上海生工公司）0.25 uL，DNA模板0.5μL，雙蒸水l8.25μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，54.5℃退火1 min，72℃延伸1 min（30個循環），72℃最后延伸10 min。取5μL PCR產物，進行1%瓊脂凝膠電泳，紫外燈下檢測。

1.2.4 藥敏試驗 將純培養得到的真菌、細菌接種在液體培養基中連續培養，制備合適濃度的菌液，均勻涂布于固體培養基表面，等待至表面無明顯菌液后，將藥敏紙片分別貼在培養基表面，分別放在35℃（細菌）和28℃（真菌）連續倒置培養。按照抑菌圈的大小判斷菌株對藥物的敏感度。設置標準為：抑菌圈直徑小于10 mm，定為對此藥物不敏感；抑菌圈直徑在10~15 mm之間，定為對此藥物中度敏感；抑菌圈直徑大于15 mm，定為此對藥物高度敏感[2]。

2 結果

2.1 細菌和真菌的培養特性

配子體克隆被微生物污染后，細菌（編號為01016XJ）附著在克隆體表面呈絮狀，見圖1E。真菌（編號為01016C和01016X）纏繞在克隆之間，見圖1B和1C。

細菌分離出的單個菌落（圖2）中等大小，圓形，灰白色，格蘭氏染色顯示為陰性桿菌。

真菌01016C長出的菌落（圖3-A，C）為白色棉絮狀，開始時菌絲放射狀生長明顯，后期匍匐生長，可以布滿整板，在液體培養基中成團或絮狀生長。在倒置顯微鏡下（圖4-A，C），菌絲長且直，孢子長橢圓狀，有的略帶彎曲，形狀均一，內有分隔，3~5個不等。

真菌01016X（圖3-B，D）菌落生長速度比粗絲慢，菌落小，不可以鋪滿整板，略帶淡黃綠色，在液體培養基中均勻渾濁生長。在倒置顯微鏡下（圖4-B，D），菌絲彎曲，分枝多。孢子呈啞鈴狀，長橢圓狀等多種形狀，有的可見2個分隔，其中可見長的散在的分枝。

圖1 被真菌和細菌污染的克?。?00×）

圖2 細菌單個菌落和革蘭氏染色

圖3 真菌的分離培養

2.2 PCR結果

圖4 兩株真菌顯微鏡下菌絲和孢子形態

利用真菌18 s rDNA通用引物和細菌16 s rDNA通用引物擴增出來的目的條帶長度分別位于500~700 bp之間和1 600 bp左右（見圖5）與預期大小一致。

圖5 真菌01016C、真菌01016X和細菌01016XJPCR瓊脂糖凝膠電泳

2.3 序列比對結果

將所測的基因序列在GenBank中比對發現，與真菌01016C 18 s rDNA ITS序列同源性較高的都是鐮刀菌屬真菌（Fusarium），同源性為100%。與真菌01016X 18 s rDNA ITS序列同源性較高的是叢赤殼屬真菌（Nectria），同源性為99%。與細菌01016XJ 16 s rDNA序列同源性較高的是γ一變形菌綱鹽單胞菌屬（Halomonas），同源性為99%。

真菌通過ITS區域比對，序列相似性≥99%，判定為相同種；序列相似性≥95%且＜99%，判定為相同屬；序列相似性＜95%，判定為同科[3]。對于細菌一般認為16 s rDNA序列相似性≥99%，可以認為是同一個種；序列相似性≥95%且＜99%，判定為相同屬；序列相似性在93%～95%之間，可以認為是不同的屬[4]。

因此，依據上述結果該試驗所分離的真菌01016C為鐮刀菌屬真菌，真菌01016X為叢赤殼屬真菌，細菌01016XJ為鹽單胞菌屬細菌。

2.4 藥敏試驗結果

真菌藥敏試驗的結果見表1。結果顯示真菌01016C對制霉菌素中度敏感；真菌01016X對制霉菌素中度敏感，對先鋒霉素則是高度敏感（表1），細菌菌株01016XJ的藥敏試驗結果見表2。

表1 兩株真菌對6種藥物的藥敏試驗結果

表2 細菌藥敏試驗結果

3 討論

鐮刀菌屬（Fusarium）是真菌中的一屬。它在自然界中分布極廣，在土壤、淡水和海水中均有分布，而且分類系統極為復雜，形態變化差異很大。它可侵染多種植物，造成植物的葉片萎焉、根系腐爛、果穗腐爛等好多類型的腐爛病癥，從而引起產量嚴重下降，造成巨大的經濟損失。鐮刀菌的有性時期分別屬于肉座菌科（Hypocreaceae）的赤霉屬（Gillerella）、叢赤殼屬（Nectria）、麗赤殼屬（Calonectria）和小赤殼屬（Micronectriella）等[5]。該試驗中分離得到兩株真菌01016C和01016X雖然從形態上有較大差別，但仍然不排除是一種真菌的不同時期，要確定這兩株真菌是不是屬于一種真菌的不同的時期，屬于哪種時期，還有待進一步的深入研究和探討。

鹽單胞菌（Halornonas）是一類能在NaC1質量分數為0～5.13 mol/L條件下生長的嗜鹽鹽微生物，在鹽湖、鹽場、鹽堿地、海冰和海洋等環境中都有分布。嗜鹽微生物主要包括嗜鹽古菌和嗜鹽細菌。嗜鹽古菌在分類學上，主要屬于鹽桿菌科，嗜鹽細菌則廣泛分布在細菌域的分枝中[6]。該試驗分離出的細菌從培養特性和16 s rDNA序列同源性比對結果都符合鹽單胞菌屬特性，后續可以進行更多的實驗，如生化試驗、耐鹽度試驗、溫度試驗等，進一步對此菌的特性和歸屬進行更細致的研究。

目前還沒有海帶配子體克隆受多種微生物污染的相關報道，該試驗中受上述微生物污染的海帶配子體克隆表現為生長緩慢，色素減少，甚至死亡的癥狀，這些癥狀是3種微生物共同作用的結果，還是其中一種或兩種作用的結果，是由于微生物分泌毒素，還是其他原因仍需進一步研究。此外藥敏試驗的結果也為配子體克隆的污染篩選出了最佳的治療藥物，為種質保存工作中微生物污染的防治提供了一定的理論依據。