ANXA 2、STAT 3、VEGF在乳腺癌中的表達及與腫瘤轉移的關系△

李建麗，李永梅，康鴻斌，王霞

內蒙古醫科大學附屬醫院甲乳外科，呼和浩特010050

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發病率呈逐年升高及年輕化趨勢[1]。目前，早期乳腺癌患者的治療效果較好，預后良好，但晚期乳腺癌患者的病死率較高、預后較差[2]，故抑制乳腺癌轉移成為治療乳腺癌的重要靶點之一。膜聯蛋白A2（annexin A2，ANXA2）是annexins家族成員之一，研究顯示，ANXA2在侵襲轉移性強的惡性腫瘤中表達水平較高，其異常表達可能與腫瘤細胞轉移密切相關[3]。信號轉導與轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）是一種在哺乳動物細胞中廣泛表達的轉錄因子，可參與細胞因子和生長因子介導的信號傳遞過程[4]。研究發現，由STAT3介導的信號異常出現在頭頸部癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌和多發性骨髓瘤等多種惡性腫瘤中[5-6]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種直接作用于血管內皮細胞的生長因子，具有強大的促進內皮細胞增殖和誘導新生血管生成的作用，而腫瘤細胞生長和轉移與新生血管生成密切相關[7]。然而，目前有關乳腺癌轉移的相關分子生物學機制尚不清楚。因此，本研究對ANXA2、STAT3、VEGF在乳腺癌中的表達情況進行分析，并探討其與乳腺癌轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月至2019年5月內蒙古醫科大學附屬醫院收治的女性乳腺癌患者。納入標準：①均經組織病理學檢查確診為乳腺癌；②均為初診患者；③既往均未接受過放化療治療；④臨床資料完整。排除合并急性感染性疾病、血液系統疾病、免疫系統疾病及其他惡性腫瘤的患者。依據納入和排除標準，本研究共納入98例女性乳腺癌患者，年齡33～76歲，中位年齡51歲；絕經56例，未絕經42例；病理類型：浸潤性導管癌72例，導管內癌26例；淋巴結轉移43例，無淋巴結轉移55例；TNM分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期44例，Ⅲ期26例；遠處轉移12例，無遠處轉移86例；人表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表達陽性24例，HER2表達陰性74例；上皮鈣黏素（E-cadherin）表達陽性47例，E-cadherin表達陰性51例；神經鈣黏素（N-cadherin）表達陽性53例，N-cadherin表達陰性45例；基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）表達陽性 38例，MMP2表達陰性60例；MMP9表達陽性41例，MMP9表達陰性51例。取98例乳腺癌患者的乳腺癌組織及相應的癌旁正常組織作為檢測樣本，經焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水清洗、拭干后，立即放入液氮中，并于-80℃冰箱保存待測。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑和儀器Trizol試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，Prime Script?逆轉錄酶試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒均購自日本Takara公司，實時定量PCR儀購自美國ABI公司，Nanodrop 200超微量分光光度計購自美國Thermo Fisher公司，ANXA2、STAT3、VEGF引物由中國生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。

1.2.2 實時定量RT-PCR檢測ANXA 2、STAT 3、VEGFmRNA的相對表達量 依據Trizol試劑盒操作說明書提取組織總RNA，DEPC水解，采用Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測總RNA的純度及濃度，再應用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。參照PrimeScript?逆轉錄酶試劑盒操作說明書進行反轉錄獲得cDNA，反應體系為20 μl，反應條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃5 min，-20℃保存待用。ANXA2上游引物5'-GCCATCAAGACCAAAGGTGT-3'，下游引物5'-TCAGTCTGATGCAAGTTCC-3'；STAT3上游引物5'-CCAGTCAGTGACCAGGCAGAAG-3'，下游引物5'-GCACGTACTCCATCGCTGACA-3'；VEGF上游引物 5'-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3'；5'-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3'；以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，GAPDH上游引物 5'-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3'，下游引物 5'-ATGATCTT2GAGGCTGTTGTCATA-3'。參照實時定量RT-PCR試劑盒操作說明書，反應體系為25 μl，反應條件：95℃預變性30 s，95℃退火5 min，60 ℃延伸30 s，40個循環。以采用2－△△Ct方法計算ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相對表達量，每組取3個復孔均值，根據各樣本的平均Ct值和ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH），計算2-ΔΔC（tΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCtGAPDH），其數值表示目的基因相對于內參基因的相對倍數。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.00軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織和癌旁正常組織中ANXA 2、STAT 3、VEGF mRNA相對表達量的比較

乳腺癌組織中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相對表達量均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

2.2 乳腺癌組織中ANXA 2、STAT 3、VEGF的相關性

乳腺癌組織中ANXA2與STAT3、VEGF的表達均呈正相關（r=0.571、0.522，P＜0.05），STAT3與VEGF的表達呈正相關（r=0.604，P＜0.05）。

2.3 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中ANXA 2、STAT 3、VEGF mRNA相對表達量的比較

不同年齡、絕經情況、病理類型的乳腺癌患者乳腺癌組織中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同TNM分期、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況、HER2表達情況、E-cadherin表達情況、N-cadherin表達情況、MMP2表達情況和MMP9表達情況乳腺癌患者乳腺癌組織中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表1 乳腺癌組織和癌旁正常組織中ANXA 2、STAT 3、VEGF mRNA相對表達量的比較

表2 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中ANXA 2、STAT 3、VEGF mRNA的相對表達量

3 討論

乳腺癌是威脅女性生命健康的常見惡性腫瘤之一。盡管隨著醫療技術的快速發展，乳腺癌患者的生存期及預后得到了明顯改善，但晚期乳腺癌患者的生存期及預后仍然較差[8]。遠處轉移是影響乳腺癌患者預后的重要因素，也是導致患者病死的主要原因[9]。因此，抑制乳腺癌患者腫瘤細胞的遠處轉移對改善患者的預后有重要意義。腫瘤細胞可以通過不同途徑轉移至鄰近或遠處的組織器官，進而形成新的繼發腫瘤灶[10]。目前研究發現，在腫瘤細胞轉移過程中，抑癌基因的失活、突變及原癌基因的異常表達可能誘發或促進腫瘤細胞的轉移[11]。

ANXA2蛋白是一種可調節纖溶酶原活化系統的蛋白質，而纖溶酶原活化系統與多種生物學活動，如血管生成、細胞外基質降解、MMP及生長因子的活化有關，均有助于腫瘤的侵襲轉移[12-13]。研究顯示，ANXA2在胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和前列腺癌等惡性腫瘤中均表達上調，特別在侵襲轉移性強的惡性腫瘤中，表明ANXA2的異常表達可能與腫瘤細胞的轉移密切相關[14-15]。STAT3是STAT家族最重要的成員，參與細胞因子和生長因子介導的信號轉導，其在頭頸部癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌得多種惡性腫瘤中發揮致癌作用[16]。研究顯示，STAT3可以調控影響細胞周期進程或抑制細胞凋亡的因子，如cyclin家族及MMP家族等[17]。STAT3還可調控腫瘤細胞VEGF的表達[18]，而VEGF具有強大的促進內皮細胞增殖和新生血管生成的作用，其是血管生成的重要因素之一，而腫瘤細胞生長和轉移與新生血管生成密切相關[19]，抑制STAT3的表達可能有助于阻止腫瘤血管生成和轉移。但目前有關乳腺癌轉移的相關分子生物學機制尚不清楚，有關ANXA2、STAT3、VEGF在乳腺癌組織中的表達情況及與乳腺癌轉移關系的研究也較少。

本研究結果顯示，乳乳腺癌組織中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相對表達量均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P＜0.05），與Chen等[20]和Yuan等[21]的研究結果一致，表明ANXA2、STAT3、VEGF在乳腺癌組織中的表達上調。此外乳腺癌組織中ANXA2與STAT3、VEGF的表達均呈正相關，STAT3與VEGF的表達呈正相關，表明三者之間存在緊密的相互作用關系。本研究結果顯示，不同TNM分期、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況、HER2表達情況、E-cadherin表達情況、N-cadherin表達情況、MMP2表達情況和MMP9表達情況乳腺癌患者乳腺癌組織中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。這可能是因為E-cadherin表達下調、N-cadherin表達上調可促進上皮-間充質轉化，而上皮-間充質轉化又與腫瘤細胞轉移密切相關[22]，同時，MMP2、MMP9能降解血管基底膜和細胞外基質中的膠原成分，促成腫瘤細胞向遠處轉移[23]，表明ANXA2、STAT3、VEGF表達上調與乳腺癌細胞的遠處轉移密切相關。值得注意的是，HER2陽性表達乳腺癌患者乳腺癌組織中ANXA2、STAT3、VEGFmRNA的相對表達量均高于HER2陰性表達患者，這可能是因為HER2陽性表達（過表達或擴增）的乳腺癌患者惡性程度高、進展快速、易轉移[24]，間接表明ANXA2、STAT3、VEGF表達上調可能與HER2陽性乳腺癌的轉移有關。

綜上所述，ANXA2、STAT3、VEGF在乳腺癌組織中表達上調，且與乳腺癌的轉移密切相關。