轉錄激活因子-4、第二個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑在卵巢癌組織中的表達及臨床意義

于欽德，陳傳鳳，吳海衛

淄博市第一醫院1婦科，2腫瘤一科，山東淄博255200

卵巢癌的發病率較高，嚴重威脅患者的健康和生命，在部分高危人群中，卵巢癌的發病率可超過約578/10萬[1]。卵巢癌具有較高的病死率和致殘率，中晚期患者的病情進展速度較快，遠期多器官功能衰竭的風險較高[2]。在研究卵巢癌發病分子機制的過程中，越來越多的研究關注到，腫瘤調控蛋白的改變能夠在卵巢癌細胞生物學行為的調控過程中發揮作用。轉錄激活因子-4（activating transcription factor-4，ATF-4）是轉錄調控相關因子，能夠提高腫瘤細胞上游轉錄本序列的閱讀開放框的激活程度，最終加速卵巢癌細胞核DNA的異常分裂[3-4]。第二個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑（second mitochondria-derived activator of caspase，SMAC）是線粒體活性調節因子，能夠通過穩定線粒體和細胞能量代謝，最終穩定腫瘤細胞的增殖過程[5]。為了揭示ATF-4、SMAC的表達與卵巢癌的關系，從而深入揭示卵巢癌的發病機制，并為卵巢癌的診療提供參考，本研究選取90例卵巢癌患者的卵巢癌組織，探討ATF-4、SMAC蛋白的表達情況與卵巢癌患者病理特征的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年9月至2018年4月淄博市第一醫院收治的卵巢癌患者。納入標準：①卵巢癌的診斷符合相關診斷標準[6]；②卵巢癌組織來源于手術后，經病理學檢查證實為上皮性卵巢癌；③患者手術前未接受放化療、免疫學治療；④臨床資料完整。排除標準：①合并盆腔、腹腔等其他類型腫瘤；②合并生殖系統、泌尿系統和盆腔感染性疾病；③伴有免疫系統疾病。根據納入和排除標準，本研究共納入90例卵巢癌患者，其年齡為36～67歲，平均年齡為（55.1±8.0）歲；國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）：I期22例，Ⅱ期37例，Ⅲ期28例，Ⅳ期3例；病灶直徑：≥5 cm 50例，＜5 cm 40例；有淋巴結轉移44例，無淋巴結轉移46例；組織學分級：G1級24例，G2級37例，G3級29例；病理學類型：漿液性囊腺癌64例，黏液腺癌26例。另選取90例卵巢良性腫瘤患者，其年齡為38～69歲，平均年齡為（57.8±7.0）歲；黏液性囊腺瘤52例，漿液性囊腺瘤28例，其他類型10例。兩組患者的年齡、FIGO分期等一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。分別收集兩組患者的卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織標本進行研究。

1.2 免疫組織化學染色方法檢測蛋白陽性表達率

收集患者的卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織，3%的過氧化氫室溫條件下孵育20 min，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗3次，每次5 min，采用PBS稀釋后的山羊血清封閉抗體5 min，倒去血清后不清洗，滴加一抗（稀釋濃度為1∶1000）5 ml，37℃孵育2 h，或置于4℃冰箱過夜孵育，PBS清洗3次，每次5 min，滴加生物素熒光標記的二抗（稀釋濃度為1∶2000）3 ml，37℃孵育20～30 min，PBS清洗3次，每次5min，加入鏈霉親合素/辣根過氧化物酶（horseradish peroxidas，HRP）標記的鏈霉卵白素，37℃孵育 20～30 min，PBS清洗3次，每次5 min，采用增強型HRP-二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）底物顯色試劑盒（PA110）顯色，自來水沖洗，復染，封片。

1.3 免疫組織化學染色結果判定標準

ATF-4、SMAC蛋白定位于細胞核、細胞質，當二者染色呈黃色、棕黃色、褐色時，說明為陽性表達。依據染色程度進行評分：未染色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，褐色、黑色計3分。依據陽性細胞所占百分比進行評分：≤10%計1分，11%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。將染色程度與陽性細胞所占百分比的評分相乘，＜3分為ATF-4、SMAC表達陰性，≥3分為ATF-4、SMAC表達陽性。

1.4 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中ATF-4、SMAC蛋白的陽性表達情況

免疫組化染色結果顯示，上皮性卵巢癌組織中ATF-4的陽性表達率為70.00%（63/90），明顯高于卵巢良性腫瘤組織的35.56%（32/90），差異有統計學意義（χ2=21.422，P＜0.01）。卵巢癌組織中SMAC蛋白的陽性表達率為45.56%（41/90），明顯低于卵巢良性腫瘤組織的80.00%（72/90），差異有統計學意義（χ2=22.848，P＜0.01）。

2.2 上皮性卵巢癌組織中ATF-4、 SMAC蛋白表達與上皮性卵巢癌患者病理特征的關系

FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、組織學分級為G3級的上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中ATF-4蛋白的陽性表達率均高于FIGO分期為I～Ⅱ期、無淋巴結轉移、組織學分級為G1～G2級的患者，差異均有統計學意義（χ2=6.582、5.726、7.871，P＜0.05）；FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、組織學分級為G3級的上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中SMAC蛋白的陽性表達率均低于FIGO分期為I～Ⅱ期、無淋巴結轉移、組織學分級為G1～G2級的患者，差異均有統計學意義（χ2=7.436、8.897、10.667，P＜0.01）；不同病灶直徑的上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中ATF-4、SMAC蛋白的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同病理特征上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中ATF-4、SMAC蛋白的陽性表達情況（n=90）

3 討論

較高的基礎發病率和遺傳傾向均能夠促進卵巢生發上皮細胞的異常病變，加劇病情進展。具有多次流產、月經紊亂或多囊卵巢綜合征的患者，其遠期發生卵巢癌的風險較高[7-8]。對于卵巢癌患者病理特征的評估能夠在卵巢癌的診療及治療方案的制定等方面發揮作用。腫瘤蛋白或腫瘤標志物的研究能夠對評估卵巢癌的病理特征提供依據。雖然血清糖類抗原19-9或糖類抗原125能夠在卵巢癌的診療過程中發揮作用，但依靠其單獨評估卵巢癌患者病理特征的局限性仍然存在，其對于卵巢腫瘤患者綜合性病情評估的可靠性較低[9-11]。計算機斷層掃描（CT）等影像學檢查能夠在卵巢腫瘤患者病情評估中發揮作用，但其滯后性較為明顯。本研究通過對卵巢癌組織中ATF-4、SMAC蛋白的表達情況進行分析，旨在為卵巢癌的臨床診療提供更為可靠的參考，提供新的研究方向和參考靶點。

ATF-4是轉錄調控相關因子，主要表達于轉錄上游啟動子開放閱讀區，在轉錄增強子的激活過程中，其過度表達能夠明顯促進卵巢癌細胞的異常轉錄。從分子機制水平進行分析，認為ATF-4對于卵巢生發上皮細胞凋亡速率的影響能夠使卵巢癌細胞的凋亡比例降低。SMAC是線粒體促凋亡蛋白，主要表達于腫瘤細胞膜周邊和線粒體膜周邊，在腫瘤細胞能量獲得或三磷酸腺苷合成過程中發揮重要的調控作用。有研究者發現，ATF-4蛋白在卵巢癌中的表達濃度明顯上升[12-14]，但對于SMAC的分析不足。

本研究通過免疫組化分析可見，卵巢癌組織中ATF-4蛋白的陽性表達率明顯升高，而SMAC的陽性表達率明顯下降，二者在卵巢癌中存在差異性表達的趨勢，這主要與ATF-4、SMAC的作用機制或轉錄生成調控的異常有關：ATF-4陽性表達率的升高主要與腫瘤細胞轉錄信號通路的激活有關，而SMAC陽性表達率的下降主要與腫瘤細胞線粒體穩定性下降導致SMAC蛋白的合成減少有關。陳雨薇等[15]發現，卵巢癌組織中SMAC蛋白的陽性表達率可下降30%以上，在卵巢癌細胞生物學行為惡化較為明顯的組織中，SMAC蛋白的陽性表達率可繼續下降。不同病理特征卵巢癌患者卵巢癌組織中ATF-4、SMAC蛋白的表達存在明顯差異，其中，FIGO分期較晚、發生淋巴結轉移、分化程度較差的卵巢癌患者卵巢癌組織中ATF-4蛋白的陽性表達率較高，SMAC蛋白的陽性表達率較低，提示ATF-4、SMAC蛋白的差異性表達與卵巢癌患者的病理特征有關。ATF-4蛋白對卵巢癌患者病理特征的影響主要在于ATF-4能夠通過激活下游絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）或蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號通路，促進卵巢生發上皮細胞上皮-間充質轉化；而SMAC陽性表達率的下降對于卵巢癌患者病理特征的影響主要在于其能夠影響細胞器結構的穩定性，導致卵巢癌細胞的變形和浸潤能力的改變，最終影響卵巢癌細胞的分化、黏附及浸潤。但本研究中并未發現ATF-4、SMAC蛋白的表達對于卵巢癌細胞直徑的影響，提示ATF-4、SMAC的表達并不會影響卵巢癌患者的一般性臨床特征。

綜上所述，卵巢癌組織中ATF-4蛋白的陽性表達率明顯升高，SMAC蛋白的陽性表達率明顯下降，且與卵巢癌的FIGO分期、淋巴結轉移和組織學分級情況有關。ATF-4、SMAC蛋白與卵巢癌患者預后的關系有待今后進一步探索。