膽綠素還原酶在抗腫瘤治療中作用的研究進展△

周陽，劉慧，張華，朱大嶺，劉芳#

1哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院呼吸內科三病區，哈爾濱150081

2秦皇島市衛生學校教務科，河北 秦皇島066000

3哈爾濱醫科大學大慶校區中心實驗室，黑龍江大慶163319

二十世紀60年代，作為一種將膽綠素轉化為膽紅素的關鍵酶，膽綠素還原酶（biliverdin reductase，BVR）首次被發現。BVR最初僅被認為在血紅素的代謝過程中發揮作用，但隨著研究的不斷深入，人們發現其在腎癌、食管癌和肺癌等多種腫瘤的細胞中過表達，且其表達具有明顯的組織特異性，與腫瘤的發生、發展的關系密切。此外，BVR在腫瘤細胞上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的過程中亦發揮著重要作用，從而參與腫瘤細胞的轉移。雖然BVR調控腫瘤的機制目前已取得一些初步的研究結果，但尚不為人所知。本文系統闡述了BVR與腫瘤的關系、調控腫瘤的具體機制、在細胞內外轉運物質的機制、在細胞內發揮抗氧化功能的特性以及作為轉錄因子調控蛋白質合成的機制，旨在為腫瘤發生、發展機制的研究提供新的思路，為臨床抗腫瘤治療提供潛在靶點。

1 BVR的結構和功能

BVR是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴酶，在NADPH存在的情況下，可以將膽綠素還原成膽紅素[1]。巰基（sulfhydryl group，SH）是BVR酶功能存在的基礎，作為一種相對少有的雙重特異性蛋白激酶，BVR既能使絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，又能使酪氨酸磷酸化，因此，其成為蛋白質磷酸化的關鍵酶[2]。BVR具有特征性的功能結構，包括亮氨酸拉鏈DNA序列、核定位序列和核輸出序列。受刺激后，BVR能進入細胞核或細胞質膜，與啟動子同源序列綁定，發揮核轉錄因子的作用，在轉錄水平調控基因的表達[3-4]。這些大數量的多功能序列結構使BVR成為功能信號轉錄途徑中的重要調節因子。此外，BVR具有2個酪氨酸激酶Src同源區2（Src homology 2，SH2）結構域，SH2結構域介導的蛋白結合在多種酪氨酸激酶始動的細胞增殖信號中發揮著重要作用。Src家族同源結構域正逐漸成為新的抗腫瘤治療靶點[4]。BVR主要通過以下3種方式對腫瘤細胞發揮調節作用：①作為還原酶；②作為雙特異性激酶；③作為堿性區-亮氨酸拉鏈（basic region-leucine zipper，bZIP）型轉錄因子。因此，基于BVR的多種作用途徑及其蛋白質多重結構的特征，其與整個細胞信號級聯網絡的關系密切。

2 BVR與腫瘤的關系

在多種酶和細胞因子的作用下，異常細胞信號通路的轉導和激活是腫瘤發生、發展的分子基礎。早在1999年，Maines等[5]首先采用免疫熒光等方法發現BVR在腎癌細胞中過表達，活化后的BVR定位于細胞核，調控細胞周期相關基因的的異常表達。隨后，Zhang等[6]發現人膽綠素還原酶（human biliverdin reductase，hBVR）在食管鱗狀細胞癌組織中呈高表達，并通過蛋白質組學等方法證實BVR可作為食管鱗狀細胞癌的腫瘤標志物。此外，Hellman等[7]利用患者的新鮮組織標本，采用二維凝膠電泳和MALDI-TOF質譜技術分析證明BVR可作為聯合診斷陰道癌的有效分子標志物，尤其對于早期宮頸癌的的篩查有重要意義。這些研究進一步驗證了BVR在惡性腫瘤發生、發展中的重要地位。

近年來，研究發現，BVR在腫瘤的轉移中發揮重要作用，在一定因素下可促進腫瘤細胞發生EMT。EMT以上皮細胞失去極性獲得間葉細胞樣細胞形態和功能為特征，是腫瘤轉移的基礎[8]。2008年有研究首先發現BVR通過磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號轉導通路介導了低氧誘導的腎小管上皮細胞EMT，是導致慢性腎纖維化從而發生腎功能衰竭的主要原因[9]。隨后，朱大嶺教授課題組發現BVR在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于正常組織，BVR通過調控細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信號通路誘導乳腺癌細胞發生EMT[10]。此外，在肺癌方面，該課題組采用免疫組化、免疫熒光、蛋白質印跡法（Western-blot，WB）和si-hBVR等方法證明了BVR能夠介導肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）誘導的非小細胞肺癌細胞的EMT[11]。hBVR在肝癌和皮膚癌等惡性腫瘤中均過表達，且與患者的分期和預后有關，但在少數腫瘤中無表達[12]，說明BVR在腫瘤組織中的表達具有明顯組織特異性。

3 BVR調控腫瘤的機制

3.1 BVR調節腫瘤相關信號通路

3.1.1 MAPK信號通路 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路在調控腫瘤細胞的代謝、增殖、運動、分化和凋亡過程中發揮重要作用，是促進多種惡性腫瘤發生、發展的經典通路[13]。它是一個從迅速加速纖維肉瘤蛋白（rapidly accelerated fibrosarcoma，RAF）到絲裂原活化的胞外信號調節激酶（mitogen-activated extracellular signal regulated kinase，MEK）再到MAPK的核心級聯反應。ERK是MAPK家族的主要亞族，包括ERK1和ERK2兩個亞型，是將信號從細胞膜傳導至細胞核的關鍵。研究表明，hBVR對ERK的激活具有重要意義（圖1a）。胰島素樣生長因子（insulinlike growth factor，IGF）-1作為IGF/MAPK通路中的配體可以激活ERK[4]。hBVR是ERK的底物，在BVR過表達的情況下，ERK可以與之形成復合物，并發揮雙向轉運體的功能。當信號通路處于靜止狀態時，ERK固定于細胞質中；一旦ERK被磷酸化，hBVR可將其轉運入細胞核[4]。此外，在細胞核中，hBVR還可使ERK1/2與轉錄激活因子ETS樣蛋白1（ETS-like 1，ELK-1）接近，磷酸化并激活ELK-1，調控腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等生物學行為[14]。

圖1 BVR調控腫瘤相關信號通路示意圖

3.1.2 PI 3K/AKT信號通路PI3K/AKT信號通路是影響腫瘤發生、發展的經典信號通路之一[15]。PI3K家族包括許多脂質激酶，由一個調節亞基（p85）和一個催化亞基（p110）組成。AKT是PI3K重要的下游分子，對于調控PI3K/AKT信號通路具有重要作用[16]。BVR可與PI3K-p85相互作用，促進AKT信號轉導和白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的產生[17]。BVR結構中存在兩個SH2結合位點，包括Y198MKM和Y228LSF，它們是調控PI3K/AKT通路的關鍵結合位點。其中，Y198MKM是PI3K調控亞基p85的理想結合位點，而Y228LSF與BVR蛋白質酪氨酸磷酸化功能的發揮關系密切[18]。此外，BVR作為一種保護細胞的信號蛋白，還可以通過激活PI3K通路發揮氧化應激的功能。因此，BVR在PI3K/AKT信號通路調控腫瘤的生長和轉移中扮演了重要的角色。

3.1.3 PKC家族與BVR的關系 蛋白激酶C（protein kianse C，PKC）既是細胞內重要的信號傳導因子，參與細胞的發生、發展，也是多種信號通路的關鍵控制點和連接樞紐[19]。依據PKC調節區結構和酶學特點的不同，PKC家族分為3個亞組和眾多亞型。其中，PKCδ可作為G蛋白偶聯受體系統中的效應物在多種信號通路中發揮重要作用，是控制細胞生長、增殖及葡萄糖信號傳導的關鍵調節因子[20]。研究表明，BVR可以通過鋅離子螯合半胱氨酸殘基的機制結合至PKC的C1結構域上（圖1b），觸發PKCδ構象發生改變，調控其功能發生變化[21]。研究已證實，PKCδ在MAPK和PI3K/AKT雙重通路中起著樞紐的作用，發揮著Cross talk的功能（圖1c）。因此，BVR可通過調控PKCδ的活性調節此兩條經典腫瘤相關信號通路的功能[17]。

3.1.4 BVR、Erk 1/ 2、PKC δ復合物 有研究顯示，BVR可與Erk1/2、PKCδ形成復合物，從而激活BVR，促進腫瘤生長因子如核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）活性的增加[4]。hBVR含有C盒和D盒序列，其中，C盒序列是hBVR與ERK結合的關鍵序列，而D-盒序列是hBVR與PKCδ相互作用的關鍵序列[14]。因此，在此復合物中，BVR作為支架，使底物ERK與其激活的PKCδ或MEK接近，不僅提供了蛋白相互作用的平臺，還起到了維持蛋白質活性構象的功能。此外，該復合物還可以利用BVR的抗氧化應激作用保護PKCδ避免被分解，從而抑制細胞凋亡。因此，通過此復合物使BVR發揮調控Erk1/2和PKCδ相關信號通路的功能，是多種腫瘤發生、發展的關鍵[22]。

3.2 BVR的轉錄激活功能

BVR除了磷酸化修飾功能外（圖2a），還具有轉錄激活功能。BVR的DNA結構含有亮氨酸拉鏈特征性功能序列，該序列是重要的結構模體，見于多種轉錄因子，具有轉錄激活作用。受刺激后，BVR能進入細胞核與啟動子同源序列綁定，在轉錄水平調控基因的表達[3]。研究顯示，激活蛋白-1（activator protein 1，AP-1）啟動子序列含有BVR結合位點，是BVR作為轉錄因子直接作用的靶點。AP-1也是亮氨酸zipper蛋白的轉錄因子，其DNA序列含有EMT相關基因Snail1、Snail2等啟動子結合位點。因此，BVR可通過轉錄激活AP-1調控EMT相關基因的表達[23（]圖2b）。此外，有研究通過微陣列分析等方法發現，高表達的BVR使活化轉錄因子 2（activating transcription factor-2，ATF-2）及環磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）的編碼基因表達上調，進而激活血管內皮生長因子，刺激腫瘤血管生成，促進腫瘤的發展[24]。

3.3 BVR作為細胞內轉運體

BVR廣泛分布于大多數細胞內，可通過耗能的方式將信號和調控分子轉運至細胞內或細胞核中，從而發揮跨膜轉運的功能[25]。上述研究介紹了BVR在細胞質和細胞核之間轉運ERK的功能，就是BVR發揮跨核膜轉運功能的一個例子（圖2c）。同樣，BVR還可在細胞內轉運血紅素，從而在紅細胞分化過程中發揮作用。血紅素可以與人BVR的C端的7個氨基酸結合，共同被轉運至細胞核，然后經過一系列信號轉導激活β-珠蛋白和血紅素加氧酶1（Heme oxygenase 1，HO-1）基因。因此，BVR在細胞質和細胞核內轉運血紅素的功能對β-珠蛋白和HO-1在紅細胞分化過程中的表達具有重要意義。

圖2 BVR不同功能的示意圖

3.4 BVR的抗氧化特性

活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的升高可激活信號通路，促進細胞的增殖、代謝及血管生成，加速腫瘤的發展。因此，ROS水平升高是腫瘤細胞株的特征。作為BVR的底物和產物，膽綠素和膽紅素是已知的抗氧化劑。首先，膽紅素與谷胱甘肽具有相似的細胞保護作用，兩者相輔相成。親水性谷胱甘肽在細胞質和細胞核中發揮作用，而親脂性的膽紅素則保護細胞膜不受損害[26]。其次，膽綠素具有細胞保護功能，可在休克和急性肝炎的動物模型中，通過細胞表面的BVR誘導AKT信號轉導和IL-10表達，抑制動物體內的炎癥反應[27（]圖2d）。此外，膽汁色素可在胃癌的發展過程中發揮其抗突變特性[28]。有研究認為，膽汁色素可能對其他ROS介導的疾病起保護作用，如動脈粥樣硬化與循環膽紅素濃度呈負相關。尤為重要的是，ROS與腫瘤的發生密切相關，BVR通過其抗氧化特性抑制腫瘤的發生，發揮了細胞保護作用[29]。

3.5 BVR多肽作為潛在的細胞生長調節劑

3種BVR多肽中，肽KYCCSRK能激活BVR激酶的活性，而肽KKRILHC和肽KRNRYLSF均能抑制BVR激酶的活性[30]。其中，抑制性多肽不僅能影響BVR自身的活性，還能影響一些激酶的活性，如抑制ERK的激活。此外，多肽還可以通過破壞BVR的支架作用，抑制BVR、MEK1和ERK1/2復合物的形成（圖2e）。ERK1/2不受控制的激活是惡性腫瘤的特點之一[10]。因此，基于BVR的抑制多肽的治療藥物有望成為抗腫瘤治療的新途徑。

4 小結與展望

綜上所述，基于BVR結構的特征性和功能的多樣化，BVR以多種方式參與著腫瘤的發生與發展。BVR可以直接或間接調控兩條經典腫瘤相關信號通路（MAPK/ERK和PI3K/AKT）的活性；功能上，其不但具有傳統意義上的蛋白磷酸化作用，還具有轉錄因子、轉運物質、抗氧化以及作為多肽調節底物的特性。因此，基于BVR在腫瘤調控方面的多樣性和重要性，并隨著對其探索得不斷深入，有望成為抗腫瘤治療的新靶點。