二苯甲酮衍生物對(duì)酪氨酸酶生物活性的影響*

劉 清，曾福燃，蔣匯鋒，馮安生，鄒訓(xùn)重，游 遨

廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生態(tài)環(huán)境技術(shù)學(xué)院，廣州510300

酪氨酸酶是一種廣泛分布于人、動(dòng)物、植物以及菌類的含銅氧化酶，在結(jié)構(gòu)上屬于Ⅲ型金屬酶[1，2]。酪氨酸酶與生物體內(nèi)色素的生成有著直接關(guān)系，其在生物體內(nèi)催化成L-酪氨酸生成L-多巴，進(jìn)一步將L-多巴催化成L-多巴醌，最終多巴醌自我氧化生成黑色素[3]。人體內(nèi)酪氨酸酶活性偏低將間接導(dǎo)致多種疾病，如白癜風(fēng)、白化病以及神經(jīng)退行性疾病等[4，5]。目前，用于治療白癜風(fēng)和白化病的藥物大多來(lái)自中草藥提取物，例如提取自何首烏的2，3，5，4'-四羥基芪-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（THSG）、提取自補(bǔ)骨脂和淫羊藿的補(bǔ)骨脂素、類黃酮、芹黃素等，而相關(guān)的化學(xué)合成藥物報(bào)道較少[6，7]。

二苯甲酮衍生物廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代工業(yè)，是一類重要的紫外吸收劑，主要應(yīng)用于自由基紫外光固化清漆體系，如UV 涂料、UV 油墨等。還可用于防曬化妝品中的抗紫外線成分，以及用于醫(yī)藥行業(yè)生產(chǎn)苯乙烯聚合抑制劑以及各類香料的定香劑[8，9]。現(xiàn)選取了11 種二苯甲酮衍生物，測(cè)試其對(duì)酪氨酸酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)部分二苯甲酮衍生物表現(xiàn)出優(yōu)異的酪氨酸酶激活活性。這一發(fā)現(xiàn)為酪氨酸酶激活劑拓展了一個(gè)新的研究方向。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

2-羥基二苯甲酮、3-羥基二苯甲酮、4-羥基二苯甲酮、4-甲氧基二苯甲酮、3-甲基二苯甲酮、4-甲基二苯甲酮、4，4′-二羥基二苯甲酮、4，4′-二甲氧基二苯甲酮、4，4′-二甲氧基二苯甲酮、4，4′-二氟二苯甲酮、3-甲氧基-4，4′-二羥基二苯甲酮（均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司）；蘑菇酪氨酸酶（比活力為6680 U·mg-1，購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司）；L-β-（3，4-二羥基）苯丙氨酸（L-DOPA，純度99%，）、L-酪氨酸（均購(gòu)自英國(guó)Alfa Aesar 公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；水為去離子重蒸水。

UV-2501 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；BPZ11D 型電子天平（Sartorius）。

1.2 測(cè)試方法[5，10]

于1.5 mL 離心管中加入890 μL 磷酸緩沖溶液（pH=6.8），隨后加入20 μL 不同濃度的化合物DMSO 溶液（控制DMSO 在體系中最終濃度為2%），然后加入10 μL 溶解于磷酸緩沖溶液的酪氨酸酶（濃度為0.5 mg·mL-1），搖勻，置于25 ℃恒溫水浴10 min。向離心管內(nèi)加入80 μL 的L-DOPA 溶液（濃度為2 mg·mL-1），迅速振蕩搖勻，于25℃下進(jìn)行測(cè)試。觀察溶液在475 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值（A 值）變化，時(shí)間3 min。扣除緩沖溶液本身對(duì)試驗(yàn)的影響，根據(jù)A值增長(zhǎng)曲線求出斜率，即為酶活力值。

酶的相對(duì)活性=K/K0×100%

K 為加入化合物時(shí)反應(yīng)進(jìn)程的直線斜率；

K0為不加化合物反應(yīng)進(jìn)程的直線斜率。

2 結(jié)果與討論

2.1 11 種二苯甲酮衍生物對(duì)酪氨酸酶活性的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，選取11 種二苯甲酮衍生物，測(cè)試其對(duì)酪氨酸酶的活性影響，結(jié)果見(jiàn)表1。所選化合物結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

表1 11 種二苯甲酮衍生物對(duì)酪氨酸酶活性的影響

測(cè)試結(jié)果顯示，在選取的11 種二苯甲酮衍生物中，激活效果最好的兩種分別為4-羥基二苯甲酮與3-羥基二苯甲酮。4-羥基二苯甲酮、3-羥基二苯甲酮、2-羥基二苯甲酮與4，4′-二羥基二苯甲酮這四種化合物均在較低的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的酪氨酸酶激活活性，隨著濃度逐漸增大，其對(duì)酪氨酸酶的激活效果逐漸降低。有趣的是，當(dāng)2-羥基二苯甲酮濃度超過(guò)300 μmol·L-1后，其對(duì)酪氨酸酶的活性影響從激活轉(zhuǎn)變?yōu)橐种啤Ｒ?jiàn)圖2。

2.2 4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮對(duì)酪氨酸酶激活動(dòng)力學(xué)的機(jī)制

為進(jìn)一步研究這類化合物對(duì)酪氨酸酶的激活機(jī)制，選取了其中活性最好的兩種化合物4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮，通過(guò)測(cè)試做出Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線。見(jiàn)圖3。

如圖3 所示，4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮對(duì)酪氨酸酶激活動(dòng)力學(xué)曲線均為平行線，兩組測(cè)試的最大速率（Vmax）和表觀米氏常數(shù)（Kappm）均隨著測(cè)試樣品濃度增加而增大，根據(jù)Saboury AA 關(guān)于激活劑的理論[11]，表明兩種化合物對(duì)酪氨酸酶激活動(dòng)力學(xué)模式均為非競(jìng)爭(zhēng)性。

2.3 化合物結(jié)構(gòu)對(duì)其激活效應(yīng)的影響

這類化合物均為二苯甲酮衍生物，它們具有相同的母體結(jié)構(gòu)，但是取代基的位置、數(shù)量及取代基的差異對(duì)活性有很大的影響。

①羥基分別在4-位、3-位及2-位時(shí)，對(duì)酪氨酸酶的最大激活效率由230%降低到215%及162%。

②當(dāng)化合物中羥基的數(shù)量增加時(shí)，其對(duì)酪氨酸酶的激活活性降低，4-羥基二苯甲酮對(duì)酪氨酸酶的最大激活率為230%，而4，4′-二羥基二苯甲酮僅為160%，當(dāng)化合物中羥基的數(shù)量增加至3 個(gè)或者以上時(shí)，其對(duì)酪氨酸酶的影響由激活轉(zhuǎn)變?yōu)橐种芠12]。

③當(dāng)化合物中的羥基被氨基取代之后，其對(duì)酪氨酸酶的激活活性大幅降低，如4-氨基二苯甲酮與3-氨基二苯甲酮對(duì)酪氨酸酶的最大激活率分別僅為147%和149%。

④這類化合物中的羥基被甲氧基、甲基或氟原子取代之后，其對(duì)酪氨酸酶的激活效果大幅度降低、甚至消失。

3 小 結(jié)

本實(shí)驗(yàn)選取了11 種二苯甲酮衍生物，分別研究了其對(duì)酪氨酸酶激活效果的影響，結(jié)果顯示，大部分化合物對(duì)酪氨酸酶表現(xiàn)出良好的激活效果，其中活性最好的為4-羥基二苯甲酮，其對(duì)酪氨酸酶最大激活率達(dá)到230%。除此之外，取代基的位置、數(shù)量以及取代基本身的不同對(duì)這類化合物的活性都有很大影響。在接下來(lái)的研究中，將選取活性最好的4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮兩種化合物進(jìn)行體內(nèi)活性測(cè)試。