LC-MS/MS 法測定老年房顫患者血漿中利伐沙班的濃度

周芳妍，王曦晗，吳 芳，蔡 凡，許倍銘，陳 冰*

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院 1 藥劑科;2 老年科，上海200025

利伐沙班是一種直接作用于Xa 因子的口服抗凝藥（direct oral anticoagulant，DOAC）。2011 年經美國FDA 批準用于預防房顫、中風以及作為深靜脈血栓和肺栓塞形成的二級預防藥物[1]。但隨著利伐沙班的廣泛使用，與其出血風險相關的不良反應也明顯增加。有研究表明，使用利伐沙班非瓣膜性房顫患者大出血事件為3.6%[2]。意大利國家藥物警戒網絡記錄了2013～2017 年可疑不良反應（ADR）共有與利伐沙班相關的報告1674 份[3]。鑒于利伐沙班藥動學存在顯著個體差異[4]，認為對其進行治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM）具有一定臨床價值[5]。目前國外已有文獻報道了利伐沙班主要采用LC-MS/MS 法測定其濃度，并對患者藥動學進行了研究[6-7]，國內對利伐沙班TDM 及藥動學研究尚未見報道。本研究通過建立LC-MS/MS 法測定老年房顫患者血漿中利伐沙班的濃度，以利于進一步探討利伐沙班在患者人群中的藥動學與藥效學之間的關系，為臨床的個體化治療提供依據。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

API4000 型三重四級桿質譜儀（美國Applied Biosystems 公司）；BS224S 型精密天平（德國Sartorius 公司）。

1.2 藥品與試劑

利伐沙班對照品批號：14-XJZ-49-1，純度：>98%，規格：2 mg；利伐沙班-D4 內標批號：9-JHY-173-5，純度：>98%，規格：1 mg，均為Toronto Research Chemicals 公司產品；甲醇、乙腈為色譜純；試驗用水為蒸餾水。

空白血漿來源于臨床試驗健康志愿者剩余標本，血漿分離后于-80 ℃冰箱中保存備用。

2 方 法

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）（采用梯度洗脫:0～0.5 min，A∶B 為90∶10；0.5～4 min，A∶B 為20∶80；4～8.5 min，A∶B 為20∶80；8.5～9 min，A∶B 為90∶10；9～10 min，A∶B 為90∶10）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫為40 ℃。

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子化電離源（ESI），正離子方式檢測；離子噴射電壓：5500 V；離子源溫度500 ℃；GS1 壓力：275.8 kPa；GS2 壓力：275.8 kPa；掃描方式為多重反應監測（MRM）；利伐沙班和內標利伐沙班-D4 的離子對分別為m/z 436.4 →m/z 145.2 和m/z 440.7→m/z 145.3；解簇電壓（DP）分別為：134.78 eV 及145.06 eV；碰撞能量（CE）分別為：36.18 eV 和40 eV。碰撞室射出電壓（CXP）電壓分別為：12.25 V 和7 V。

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取利伐沙班對照品2.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成兩份濃度均為0.2 mg·mL-1的利伐沙班儲備液，用于標準曲線與質控品配制。用50%甲醇-水依次稀釋利伐沙班儲備液，得到利伐沙班濃度分別為50、100、200、500、1000、2000、5000 ng·mL-1標準曲線溶液。另取對照品儲備液稀釋至80、400、4000 ng·mL-1的低、中、高濃度的質控工作液。于-20 ℃保存備用。

2.3 內標溶液的配制

精密稱取利伐沙班-D4 內標約1.0mg，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為0.1 mg·mL-1的利伐沙班-D4 儲備液。用乙腈配制成濃度為500 ng·mL-1的內標溶液，于4 ℃冰箱內保存備用。

2.4 標準血漿樣品

分別取不同濃度的對照品工作液各10 μL，加入空白血漿100 μL，最終配制成系列濃度為5、10、20、50、100、200、500 ng·mL-1的利伐沙班標準血漿樣品。另取不同濃度的質控品工作液各10μL，加入空白血漿100 μL，最終配制成系列濃度為8、40、400 ng·mL-1的利伐沙班質控血漿樣品。

2.5 血漿樣品處理

取100 μL 血漿樣品至1.5 mL 離心管中，加入10 μL 50%甲醇-水混勻，加入200 μL 含內標溶液（500 ng·mL-1）乙腈沉淀劑，渦旋振蕩5 min，19419×g離心10 min，吸取上清液置于進樣管中，取5 μL 進樣，按“2.1”項下檢測條件進行LC-MS/MS 分析。

2.6 患者標本檢測

選取我院老年科3 名服用利伐沙班片（拜瑞妥，10 mg/片，批號：BXJ7VR1，拜耳公司）房顫患者，除利伐沙班外，近期均未服用華法林、Xa 因子抑制劑、肝素類抗凝劑等藥物。服藥劑量為20 mg qd。患者服藥達穩態后，在給藥前與給藥后2 h，經肘靜脈取血，3.0 mL 轉移至乙二胺四乙酸（EDTA）處理的抗凝管中，3000 g 離心10 min，分離的血漿于-80 ℃冰箱中保存，按“2.5”項血漿樣品處理后進樣，采用建立的LC-MS/MS 法測定血漿中利伐沙班峰的血藥濃度。

3 結果

3.1 質譜掃描

將利伐沙班和利伐沙班-D4 儲備液分別用50%甲醇-水稀釋成100 ng·mL-1的溶液，采用微量注射泵以10 μL·min-1的恒定速度泵入質譜系統，進行碎片離子分析，相應的二級全掃描質譜圖見圖1。

3.2 專屬性試驗

分別取空白溶液、50%甲醇-水基質、標準血漿樣品（加入內標溶液）和患者用藥后血漿（加入內標溶液）樣本，按“2.4”項下方法處理，按“2.1.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖2。

利伐沙班和內標利伐沙班-D4 保留時間分別為5.55 min 和5.57 min，峰形良好，血漿中內源性物質不干擾利伐沙班及內標的測定。

3.3 標準曲線及定量下限

取“2.4”項下系列標準血漿樣品，按“2.5”項下方法處理后進行分析。以待測物濃度（ng·mL-1）為橫坐標X，以利伐沙班與利伐沙班-D4 的峰面積比值為縱坐標Y，用加權（W=1/X）最小二乘法進行回歸運算，得到回歸方程Y=1.11×10-2X-1.12×10-3，r=0.999 7（n=5）。表明利伐沙班在5～500 ng·mL-1范圍內線性關系良好。最低定量下限為5 ng·mL-1，連續測定5份樣本，準確度為112.8%，精密度的RSD 為4.49%。

3.4 精密度和準確度試驗

按照“2.2”項下方法配制利伐沙班低、中、高（8、40、400 ng·mL-1）3 個濃度的質控血漿樣品。按“2.4”項下方法處理樣本，各濃度均配制5 份進樣分析，連續測定3 天。根據當日標準曲線測算質控血漿樣本的濃度，計算日內及日間精密度。見表1。

3.5 提取回收率和基質效應

表1 血漿中利伐沙班方法精密度和準確度測定結果

按照“2.2”項下方法，分別配制利伐沙班低、中、高（8、40、400 ng·mL-1）3 個濃度的質控血漿樣本，按“2.4”項下方法操作，每個濃度平行測定5 份樣本，得峰面積A；將人空白血漿按“2.5”項下方法處理，經離心后取上清液，加入適量利伐沙班對照品溶液，配制成濃度為8、40、400 ng·mL-1的質控樣品，渦旋混合后進樣得峰面積B，每個濃度平行測定5 份樣本；在50%甲醇-水中加入適量利伐沙班對照品溶液，配制成質量濃度為8、40、400 ng·mL-1的質控樣品，渦旋混合后進樣得峰面積C，每個濃度平行測定5 份樣本。利伐沙班提取回收率（%）=A/B×100%，基質效應（%）=B/C×100%。計算得到提取回收率在90.8%～101.3%，基質效在95.2%～103.3%。見表2。

表2 利伐沙班提取回收率和基質效應（n=5，）

表2 利伐沙班提取回收率和基質效應（n=5，）

同法計算內標利伐沙班-D4 的提取回收率和基質效應分別為92.2%～99.5%和95.8%～98.9%。

3.6 穩定性考察

用空白血漿配制利伐沙班低、中、高（8、40、400 ng·mL-1）3 個濃度的質控血漿樣本，每個濃度平行配制5 份。血漿樣本分別在室溫放置12 h、反復凍融3 次和-20 ℃凍存30 d，按照“2.5”項下方法處理后進樣分析，計算濃度。結果見表3。這表明在上述考察條件下，利伐沙班穩定性良好。

3.7 方法應用

3 位老年科房顫患者服用利伐沙班后，穩態谷濃度分別為30.0、14.1、38.5 ng·mL-1，而給藥后2 h的峰濃度分別為119、94.3、149ng·mL-1。上述結果存在一定個體差異，后續研究有待進一步擴大樣本量。

表3 血漿中利伐沙班的穩定性（n=5）

4 討論

目前大多研究采用LC-MS/MS 法，以ESI 正離子作為電離模式檢測。Baldelli S 等[8]采用一種固相萃取法，較好地排除了血漿中的干擾；但是操作步驟更為復雜，成本也較高。另一種處理方法是蛋白沉淀，操作較為簡便，易于批量處理，是目前LCMS/MS 法分析生物樣本的常用處理方法。

本文試驗了不同pH 環境下利伐沙班的峰型，最后選擇0.1%甲酸水-甲醇作為流動相，采用梯度洗脫的方式，檢測物質峰型良好，且避免了血漿中內源物質的干擾。選用乙腈作為沉淀劑進行蛋白沉淀，且與以前建立的檢測方法相比[9]，利伐沙班標準曲線線性范圍較寬（5～500 ng·mL-1），同時定量下限為5 ng·mL-1，低于服藥穩態后的谷濃度，能夠滿足進行TDM 與臨床藥動學研究的快速監測。

直接作用的口服抗凝藥雖與華法林相比具有更好的安全性，一般情況下不需要進行常規治療藥物監測；但由于其吸收速度快，給藥2～4 h 可達到峰值，藥動學變異系數較大，可達到30%～40%[10]。據有關研究表明，利伐沙班在每日劑量20 mg 時，2～4 h達到峰值，其峰濃度中值為270（189～419）ng·mL-1，谷濃度中值為26（6～87）ng·mL-1，谷濃度與峰濃度之間相差8～10 倍，半衰期6～13 h[5]。在固定劑量下，利伐沙班引起的出血風險和治療效果，也提示著患者個體間差異；同時目前缺乏標準化的抗凝血功能監測和抗凝逆轉劑，增加了臨床應用風險[11]。如上種種原因需在一定的情況下對DOACs 進行監測，例如創傷、緊急手術和溶栓治療窗口內的近期卒中、懷疑藥物相互作用等。此外，對于某些特殊患者如腎功能不全和胃腸吸收不良的、特別是老年人，日常監測也是必要的。

本研究對3 例服用利伐沙班達到穩態患者的血藥濃度進行了檢測，結果發現谷濃度與峰濃度分別為（27.5±12.4）ng·mL-1與（120.8±27.4）ng·mL-1，與國外研究接近且存在較大個體變異。可以預測對服用利伐沙班的特定患者進行TDM 具有較大臨床意義。