RP-HPLC 法測定藥用膠塞中16 種多環(huán)芳烴含量并作模擬提取研究

張曉蕓，劉露遙，丁逸梅

江蘇省藥物研究所有限公司，南京210009

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydro-carbons，PAHs）是一類由兩個或兩個以上苯環(huán)以稠環(huán)形式相連的有機化合物，主要包含萘、苊烯、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并蒽、艸屈、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘、茚[1，2，3-cd]并芘、二苯并[a，h]蒽和苯并苝等。含有四到六個環(huán)的稠環(huán)多環(huán)芳烴具有致癌性，1976年國際癌癥研究中心（IARC）公布了94 種動物致癌物質(zhì)[1]，其中多環(huán)芳烴化合物含有15 種，以苯并[α]芘為首個環(huán)境化學(xué)強致癌物質(zhì)；多環(huán)芳烴具有很強的脂溶性，較難降解，并且容易在生物體內(nèi)蓄積。到目前為止，歐盟2005/69/EC 指令（即76/769/EEC 之第27 次修訂版）規(guī)定橡膠油中苯并[α]芘不得超過1mg·kg-1。2005 年9 月德國發(fā)布的《德國食品和商品法》中規(guī)定，PAHs 總量的最大允許限量是10 mg·kg-1,苯并[α]芘最大允許限量是1 mg·kg-1；美國和中國等各國均通過法律或法令對多環(huán)芳烴的含量有明確的限量要求[1，2]。橡膠中多環(huán)芳烴存在于膠塞生產(chǎn)原料橡膠油中，橡膠油作為一種軟化劑可以使橡膠具有良好的彈性和韌性。注射劑等藥物常見的包裝材料為橡膠膠塞，如果膠塞中殘留的PAHs 遷移至藥液中會對患者造成危害；通常選擇藥用膠塞的材質(zhì)分為：注射用冷凍干燥無菌粉末覆聚四氟乙烯/乙烯共聚物膜氯化丁基膠塞和注射用鹵化丁基橡膠塞（氯化或者溴化）。目前，多環(huán)芳烴的檢測技術(shù)主要有化學(xué)滴定法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜法、電化學(xué)法、分光光度法及熱透鏡光度法、拉曼光譜分析法等[3-13]。其中在環(huán)境保護領(lǐng)域較為常見的主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。本文采用RP-HPLC 法測定藥用膠塞中16 種多環(huán)芳烴的含量，并作其遷移試驗。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

儀器：高效液相色譜儀LC-2010CHT（編號：C21255010791，日本島津公司）；電子分析天平（BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）;手提式壓力蒸汽滅菌器（上海劃線醫(yī)用核子儀器有限公司，編號：428）。

16 種多環(huán)芳烴混合對照品（PAHs-Solution16-22），來源：O2Si，批號：320418，質(zhì)量濃度（萘1002 mg·L-1，苊2002 mg·L-1，茐200.1 mg·L-1，二氫苊999.9 mg·L-1，菲100.2 mg·L-1，蒽100.2 mg·L-1，熒蒽200.1 mg·L-1，芘99.84 mg·L-1，艸屈100.6 mg·L-1，苯并[a]蒽100.4 mg·L-1，苯并[b]熒蒽200.1 mg·L-1，苯并[k]熒蒽100.4 mg·L-1，二苯并[a]芘100.7 mg·L-1，二苯并[ah]蒽199.9 mg·L-1，苯并[ghi]苝200 mg·L-1，茚并[1，2，3-cd]芘99.96 mg·L-1）。16 種多環(huán)芳烴混合對照品（PAHs-Mix-EPA610），來源：O2Si 標準品公司，批號：300821，質(zhì)量濃度均為200 μg·mL-1；萘對照品，來源：阿拉丁試劑公司，批號：C1819049，純度98%。

藥用膠塞：①注射用冷凍干燥無菌粉末用覆聚四氟乙烯/乙烯共聚物膜氯化丁基膠塞，來源：江蘇華蘭藥用新材料股份有限公司，批號：M170406122-78；②藥用鍍聚四氟乙烯膜氯化丁基橡膠/聚異戊二烯橡膠塞，來源：新加坡西式西藥服務(wù)公司，批號：3138 010040；③注射用鹵化丁基橡膠塞（溴化），來源：江蘇博生醫(yī)用新材料股份有限公司，批號：16 102362；④注射用冷凍干燥無菌粉末氯化丁基橡膠塞，來源：江蘇華蘭藥用新材料股份有限公司，批號：170508159-60。

藥品與試劑：注射用蘭索拉唑，來源：江蘇某藥業(yè)股份有限公司，批號：180301，180302，180303；注射用帕瑞希布鈉，來源：杭州某藥業(yè)有限公司，批號：19010814，19010914，19 011014；注射用萬古霉素，來源：浙江某藥業(yè)股份有限公司，批號：20170901，20170902，20 170903；乙腈，來源：Honeywell，批號：S3ZA1H）；乙醇、正己烷為分析純；實驗用水為重蒸水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.2 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：220（萘、苊、二氫苊）、254（茐、菲、蒽、熒蒽、芘、艸屈、苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、二苯并[a]芘、苯并[ghi]苝）、295（二苯并[ah]蒽、茚并[1，2，3-cd]芘）nm；進樣量：10 μL。流動相：色譜純乙腈、屈臣氏蒸餾水（采用梯度洗脫：0～27 min，乙腈65%；27～41 min，乙腈65%～100%；41～43 min，乙腈100%～65%；43～55 min，乙腈65%）。16 種PAHs 對照品的典型圖譜見圖1。

1.2.2 氣相色譜條件 Thermo Scientific Trace GC Ultra-ISQ 氣質(zhì)聯(lián)用儀，軟件：Xcalibur；離子源：EI；色譜柱：Agilent DB-5 MS UI（30m×250μm×0.25μm）；進樣量：1.5 μL；不分流；恒定流量：1.2 mL·min-1；進樣口溫度：280 ℃；柱溫：60 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1升至110 ℃，保持2 min，以5 ℃·min-1升至300 ℃，保持10 min；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：250 ℃；溶劑延遲：6.0 min；定量離子搜索模式（SIM）。定性與定量離子選擇見表1。

表1 定性與定量離子選擇

1.2.3 提取試驗 膠塞經(jīng)121 ℃高壓滅菌15 min后，取出剪碎，稱取約10 g，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，加20 mL 無水乙醇，50 ℃超聲4 h；取出冷卻，取上清液即為提取液。

1.2.4 遷移試驗

1.2.4.1 對照品溶液制備 精密量取PAHs 混合對照品適量，至100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋成PAHs含量為0.1 μg·mL-1的混合對照品溶液，待用。

1.2.4.2 樣品溶液制備 ①取注射用蘭索拉唑（批號：180301，180302，180303）凍干粉末3 瓶，模擬臨床使用，每瓶加入5 mL 0.9% NaCl，混合均勻；精密量取10 mL 該樣品溶液，精密加入5 mL 正己烷，渦旋5 min，靜置分層，精密量取有機層1.0 mL，用高純氮氣吹干后，加入1.0 mL 無水乙醇復(fù)溶。②取注射用帕瑞希布鈉（批號：19010814，19010914，19011014）凍干粉末，模擬臨床使用每瓶加入5mL 0.9% NaCl，取2 瓶混合均勻后備用；精密量取5.0mL 該樣品溶液，加入5 mL 正己烷，渦旋5 min，靜置分層，精密量取有機層1.0mL，用高純氮氣吹干后，精密加入1.0mL無水乙醇復(fù)溶。③取注射用萬古霉素（批號：20170901，20170902，20170903）凍干粉末，模擬臨床使用每瓶加入5 mL 0.9% NaCl，取2 瓶混合均勻后備用；精密量取5.0 mL 該樣品溶液，加入5.0 mL 正己烷，渦旋5 min，靜置分層，精密量取有機層1.0 mL，用高純氮氣吹干后，精密加入1.0 mL 無水乙醇復(fù)溶。

1.3 結(jié)果

1.3.1 提取實驗

1.3.1.1 線性范圍 精密量取PAHs 混合對照品溶液適量，用乙腈逐級稀釋，制備線性溶液，濃度分別為0.1000、0.500、1.000、5.000、10.00 μg·mL-1；精密量取上述對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀測定，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，各PAHs 在0.1000～10.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）≥0.999。以信噪比S/N=3 為最低檢出限，檢出限0.751 5 ng·mL-1～24.96 ng·mL-1；以信噪比S/N=10 為最低定量限2.505 ng·mL-1～83.20 ng·mL-1。見表2。

1.3.1.2 進樣精密度試驗 精密量取對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀測定，連續(xù)進樣5 次，測得峰面積的RSD 均≤2.0%，表明進樣精密度良好。

1.3.1.3 回收率實驗 取“1.2.3”項的膠塞10 g，共9份，使用含有濃度為0.1000、0.5000、1.000μg·mL-1的PAHs 對照品溶液20mL，按照“1.2.3”項下方法制備膠塞樣品溶液，精密量取該溶液10μL，注入液相色譜儀測定，以外標法計算得到回收率為88.74%～99.27%。

1.3.1.4 重復(fù)性試驗 取“1.2.3”項的膠塞10 g，共6 份，精密加入濃度為0.5000 μg·mL-1LPAHs 混合對照品溶液20 mL，按照“1.2.3”項下方法制備膠塞樣品溶液，精密量取該溶液10.0 μL，注入液相色譜儀測定，測得的RSD≤3.0%。

1.3.1.5 膠塞提取 對市售的藥用膠塞進行PAHs的檢測，每種膠塞按照“1.2.3”項下方法制備膠塞樣品溶液。萘、苊和二氫苊的檢測波長為220 nm，依法測定，由圖2A 可知，膠塞中可能存在萘，提取液圖譜中苊的保留時間與對照品圖譜中的苊的保留時間不一致，待GCMS 進行分子量鑒定；茐、菲、蒽、熒蒽、芘、艸屈、苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、二苯并[a]芘和苯并[ghi]苝的檢測波長為254 nm，由圖2B 可知，該類化合物均未檢出；二苯并[ah]蒽和茚并[1，2，3-cd]芘的檢測波長為295 nm，由圖2C 可知，這兩種化合物均未檢出。其提取液HPLC 圖譜見表3。

表2 16 種PAHs 的回歸方程

1.3.2 遷移實驗

1.3.2.1 萃取溶劑篩選 本實驗篩選了溶劑：乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷，乙醚沸點太低，難以精密量取；乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷對主藥部分溶解，干擾多環(huán)芳烴的檢測；多環(huán)芳烴在正己烷中溶解性較好，主藥及雜質(zhì)在正己烷中溶解性較差，使用正己烷提取干擾較少，回收率高。

1.3.2.2 回收率試驗 分別取注射用蘭索拉唑樣品（批號180301）、注射用帕瑞昔布鈉（批號19010814）和注射用萬古霉素樣品（批號20170901），精密加入含PAHs 濃度為0.1000、0.5000、1.000 μg·mL-1的乙醇溶液，按照“1.2.4.2”方法制備樣品溶液；精密量取該溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄各色譜峰峰面積，采用外標法計算回收率及RSD 值，注射用蘭索拉唑平均加樣回收率為94.28%～98.81%，RSD≤5.0%；注射用帕瑞昔布鈉平均加樣回收率為93.61%～99.43%，RSD≤5.0%；注射用萬古霉素平均加樣回收率為93.34%～98.89%，RSD≤5.0%。見表4。

表3 膠塞多環(huán)芳烴提取結(jié)果（ng·g-1）

1.3.2.3 注射液中PAHs 的測定 ①選取3 批注射用蘭索拉唑樣品（批號：180301，180302，180303），進行PHAs 遷移試驗，按照“1.2.4.2”項下方法制備樣品溶液；精密量取該溶液10.0 μL，注入液相色譜儀測定，3 批樣品中均未檢出PHAs。②取3 批注射用帕瑞希布鈉（批號：19010814，19010914，19011014），進行PHAs 遷移試驗，按照“1.2.4.2”項下方法制備樣品溶液；精密量取該溶液10.0 μL，注入液相色譜儀測定，3 批樣品中均未檢出PHAs。③取3 批注射用萬古霉素（批號：20170901，20170902，20170903）進行PHAs 遷移試驗，按照“1.2.4.2”項下方法制備樣品溶液；精密量取該溶液10.0 μL，注入液相色譜儀測定，3 批樣品中均未檢出PHAs。

2 結(jié)論

本實驗使用高效液相色譜法測定藥用膠塞中16 種PAHs，各PAH 范圍在0.100 0～10.00 μg·mL-1濃度之間內(nèi)，其峰面積與濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.999；檢測限0.751 5～24.96 ng·mL-1；定量限2.505～83.20 ng·mL-1；精密度的RSD≤2.0%；重復(fù)性的RSD≤3.0%；平均加樣回收率為88.74%～99.27%。

經(jīng)GCMS 定性分析，表明膠塞中提取物為萘，目前GCMS 也能夠?qū)AHs 良好分離，且靈敏度良好；但考慮GCMS 自身的缺陷性，適用于定性和半定量分析，且GCMS 相對成本較高。本文仍采用液-液萃取的方式，以HPLC-UV 法考察PAHs 的遷移實驗。

表4 注射用蘭索拉唑、帕瑞昔布鈉和萬古霉素中PAHs 的遷移平均回收率及RSD 值

本試驗選用注射用蘭索拉唑等3 個樣品為模型注射劑，建立了16 種PAHs 的遷移實驗，通過加標方式考察該方法的專屬性，注射用蘭索拉唑平均加樣回收率為94.28%～98.81%，RSD≤5.0%；注射用帕瑞昔布鈉平均加樣回收率為93.61%～99.43%，RSD≤5.0%；注射用萬古霉素平均加樣回收率為93.34%～98.90%，RSD≤5.0%。本試驗采用的HPLC法測定藥用膠塞中的PAHs，方法良好，能夠快捷、簡便、準確地檢測出橡膠膠塞中16 種PAHs 的含量，適用于橡膠膠塞中PAHs 的測定。通過溶劑篩選得到正己烷為注射劑藥液的合適的萃取溶劑，能夠準確考察注射液中16 種PAHs 的遷移。