還原型谷胱甘肽片改善酒精性肝損傷的作用及機制研究*

葛煒煒，吳 育**，劉兆國

1 江蘇省南通市中醫院 藥劑科，南通 226001；2 南通大學 藥學院，南通226001

我國是“飲酒”大國，且因之出現酒精性肝損傷發病年齡呈現年輕化的態勢[1]，而長期過量飲酒是造成酒精性肝病的重要原因。肝臟是酒精代謝的主要器官，因而肝臟最易受到酒精性損傷。酒精性肝病包括酒精性脂肪肝和慢性炎癥，隨著疾病的進展，最終發展成為肝纖維化直至肝硬化[2，3]，因而對酒精性肝損傷的預防和治療顯得尤為重要。臨床研究已經表明，還原型谷胱甘肽片在乙型肝炎、藥物型肝腎損傷方面具有良好的治療效果[4]，且其發揮藥理作用的主要機制是由于其結構中包含有還原性的巰基，具有較強的還原能力有關[5]，但更為深入的機制仍然不清楚。

本實驗采用小鼠長期大量酒精攝入構建酒精性肝損傷模型，研究還原性谷胱甘肽片對酒精性肝損傷的保護作用及潛在機制，為臨床和后續實驗研究提供指導。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑

還原型谷胱甘肽片（規格：100 mg/片，重慶藥友制藥有限責任公司，批號：CM8085）；陽性藥水飛薊賓（規格：35 mg/片，天津天士力圣特制藥有限公司，批號：950701001）。

小鼠丙氨酸氨基轉移酶（ALT）檢測試劑盒（批號：20190821）、小鼠天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）檢測試劑盒（批號：20190913）、小鼠堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒（批號：20190913）、總膽固醇（TC）測定試劑盒（批號：20190911）、甘油三酯（TG）測定試劑盒（批號：20190910）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）測定試劑盒（批號：20190910）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）測定試劑盒（批號：20190913），均購自于南京建成生物工程研究所有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒（批 號：050201）、小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（批號：053452）均購自杭州聯科生物技術有限公司；小鼠高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA 試劑盒（批號：L092721）購自武漢華美生物工程有限公司；Trizol 提取液（美國Thermo 公司，批號：101005）；轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司,批號：7E380H9）；Sybrgreen 試劑盒（北京全式金生物科技有限公司，批號：H2357）；羧甲基纖維素鈉等化學試劑購自國藥化學有限公司。

1.2 儀器

BP211 電子分析天平（德國賽多利斯集團）；Multiskan 型號酶標儀（美國Thermo 公司）；7500 快速實時熒光定量PCR 系統（美國ABI 公司）。

1.3 動物

SPF 級白色ICR 小鼠，體重18～20 g，均為雄性，購自揚州大學比較醫學中心，動物生產許可證號：SCXK（蘇）2017-0007。實驗動物屏障環境設置：12 h/12 h 晝夜光線。

2 實驗方法

2.1 酒精性肝損傷小鼠模型的構建和給藥

隨機將60 只雄性ICR 小鼠等分為6 組，每組為10 只，分別為空白組、模型組、水飛薊賓陽性藥組（50 mg·kg-1）、還原型谷胱甘肽片低、中、高3 個劑量組（200、400、800 mg·kg-1）。待動物適應性飼養后，除空白組外，其余5 組均灌胃給予體積分數（v/v）為50%的乙醇溶液（10 mL·kg-1），用于構建酒精性肝損傷動物模型，連續灌胃6 周[6，7]；從造模當天開始，空白組和模型組均灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；陽性藥組灌胃給予水飛薊賓溶液；還原型谷胱甘肽片各劑量組給予對應濃度的谷胱甘肽溶液（注：水飛薊賓和還原型谷胱甘肽片藥物，配制時，均采用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液作為溶劑）。各組灌胃體積均為10 mL·kg-1，動物于給藥后4 h 給予酒精造模。

2.2 小鼠體質量和肝臟指數的檢測

待造模6 周后，各組動物處理前禁食24 h，采用天平稱取小鼠體質量并作記錄。動物麻醉后，摘取動物眼球采血；解剖動物，取出肝臟組織，生理鹽水清洗、濾紙吸干，迅速置于天平中稱取各組每只動物肝臟重量并作記錄。小鼠肝組織存入冰箱備用。

2.3 小鼠血清生化因子ALT、AST、ALP 的檢測

各組小鼠摘眼球取出全血置于無菌1.5 mL 離心管中，在4 ℃冰箱中靜置12 h，1500 r·min-1離心分離小鼠血清，將小鼠血清分裝檢測。未檢測血清置于-80 ℃冰箱凍存備用。參照試劑盒說明書進行檢測血清中的ALT、AST、ALP 含量。

2.4 小鼠血清脂質相關因子TC、TG、LDL、HDL 的檢測

參照試劑盒說明書，對各組小鼠血清中TC、TG、LDL-c、HDL-c 因子進行檢測。

2.5 PCR 檢測肝臟TNF-α、HMGB-1、IL-6 的mRNA 水平

分別稱取各組小鼠新鮮100 mg 肝臟組織，采用Trizol 提取液提取組織中全部RNA，參照逆轉錄試劑盒說明書，將RNA 逆轉為相應的cDNA，按照Sybr Green 說明書進行PCR 檢測，得到各組樣本擴增曲線達到閾值的循環圈數（Ct）值，計算ΔCt=Ct目的基因-Ct內參，ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt空白組平均值，采用2-ΔΔCt法定量結果并計算相對表達量。

引物序列為：TNF-α，上游：5’-CCGACCGAATGCAGTTGGA-3’，下游：5’-ACAGAGTATCTGCGC TCCGGA-3’；HMGB-1，上游：5’-CCTCAAGGGCTGCAACGAG-3’，下游：5’-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3’；IL-6，上游：5’-ACTGAAGATCTCCCACG GCA-3，下游：5’-GGCCGCAGAATCAGCCACCA-3’；GAPDH 上游：5’-CCTGGCACCCAGTACAAT-3’，下游：5’-GCTGATCCTCTGCTGGAA-3’。

2.6 Elisa 法檢測肝臟TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎癥因子水平

分別稱取各組小鼠新鮮100 mg 肝臟組織，加入1 mL PBS 緩沖液，采用玻璃勻漿器勻漿后，12000 r·min-1離心分離上清液，參照TNF-α、HMGB-1、IL-6因子Elisa 試劑盒說明書檢測上述各因子含量。

2.7 肝臟病理學HE 檢測

分別稱取各組小鼠新鮮肝臟適量，剪取小塊肝臟組織，置于10%福爾馬林溶液中固定72 h，脫水行常規石蠟包埋，切片，按照染色步驟進行HE 染色，中性樹膠封片后，于100 倍顯微鏡下進行拍照。采用Image-Pro Plus 對切片視野中的脂滴空泡數進行計數和分析。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 還原型谷胱甘肽片對小鼠體質量和肝臟指數的影響

實驗過程中動物狀態良好，飲食飲水均正常。通過對各組小鼠體質量的檢測發現，模型組小鼠體質量與空白組小鼠體質量無顯著差異。對各組小鼠的肝臟指數進行檢測發現，相較于空白組，模型組小鼠肝臟指數明顯增加，提示長期飲酒能夠引起動物肝臟腫大；而陽性藥組和還原型谷胱甘肽片（400、800 mg·kg-1）各劑量組動物肝指數明顯減少，且與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.01），見表1。實驗表明，還原型谷胱甘肽片能夠緩解小鼠因長期飲酒導致的肝臟腫大癥狀。

表1 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠體質量和肝臟指數的影響（，n=10）

表1 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠體質量和肝臟指數的影響（，n=10）

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01。

3.2 還原型谷胱甘肽片對小鼠血清ALT、AST、ALP 的影響

通過對小鼠血清中的ALT、AST、ALP 檢測發現，動物造模后，模型組小鼠血清中的ALT、AST、ALP 明顯增高，且與空白組相比，差異具有統計學意義。治療后，陽性藥水飛薊賓組和還原型谷胱甘肽片（200、400、800 mg·kg-1）各劑量組血清中的ALT、AST、ALP 明顯降低，且與模型組相比，差異具有顯著性意義（P<0.01），見表2。實驗表明，長期飲酒能夠損傷肝組織，而還原型谷胱甘肽片對此種肝損傷具有一定的保護作用。

表2 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP 的影響（，n=10）

表2 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP 的影響（，n=10）

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01。

3.3 谷胱甘肽對小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c的影響

對各組小鼠血清中脂質相關的指標TC、TG、LDL-c 以及HDL-c 檢測發現，模型組血清中TC、TG、LDL-c 含量明顯升高，而HDL-c 含量明顯降低，且與空白組相比差異具有統計學意義；采用陽性藥水飛薊賓和還原型谷胱甘肽片治療后，陽性藥物組和還原型谷胱甘肽片（200、400、800 mg·kg-1）各劑量組血清中的TC、TG、LDL-c 含量明顯降低，而HDL-c 含量明顯升高，且與模型組相比差異具有統計學意義（P<0.01，P<0.05），見表3。實驗表明，還原型谷胱甘肽片能夠改善小鼠慢性酒精中毒后的脂質代謝異常。

表3 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c 的影響（，n=10）

表3 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c 的影響（，n=10）

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

3.4 谷胱甘肽對小鼠肝臟中TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因表達的影響

對各組小鼠肝臟組織中炎癥相關的TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的mRNA 檢測發現，模型組肝臟組織中TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的mRNA 水平明顯升高，且與空白組相比，差異具有統計學意義；采用陽性藥水飛薊賓和還原型谷胱甘肽片治療后，陽性藥組和還原型谷胱甘肽片（200、400、800 mg·kg-1）各劑量組肝臟中的TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的mRNA 水平明顯降低，且與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.01，P<0.05）。見表4。

表4 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠肝臟TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的影響（，n=10）

表4 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠肝臟TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的影響（，n=10）

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.5 還原型谷胱甘肽片對小鼠肝臟TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎癥因子水平的影響

采用試劑盒對各組小鼠肝臟組織中的TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎癥因子水平檢測結果發現，模型組肝臟組織中TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎癥因子明顯升高，且與空白組相比，差異具有統計學意義；采用陽性藥水飛薊賓和還原型谷胱甘肽片治療后，陽性藥物組和還原型谷胱甘肽片（400、800 mg·kg-1）中、高劑量組動物肝臟中的TNF-α、HMGB-1、IL-6炎癥因子明顯降低，且與模型組相比差異具有統計學意義（P<0.05，P<0.01），見表5。實驗表明，還原型谷胱甘肽片可能通過改善模型小鼠肝臟炎癥狀態，發揮保護肝臟的作用。

表5 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠肝臟TNF-α、HMGB-1 以及IL-6 因子的影響（，n=10）

表5 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠肝臟TNF-α、HMGB-1 以及IL-6 因子的影響（，n=10）

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.6 還原型谷胱甘肽片對小鼠肝臟組織形態學的影響

對各組小鼠肝臟組織檢查發現，模型組小鼠動物肝臟明顯增大，顏色偏向于暗紅，且質地較為蓬松，表明長期飲酒導致了肝臟脂肪含量增加，影響肝臟質地。通過肝組織HE 染色發現，相較于空白組，模型組小鼠肝臟炎癥水平較高，圓形脂滴空泡明顯較多（P<0.01），表明模型組肝臟脂滴含量較多、脂肪肝的狀態較為嚴重；采用陽性藥和還原型谷胱甘肽片治療后，動物肝臟脂滴空泡數顯著減少，相較與模型組肝臟炎癥和脂肪肝的狀態得以緩解，差異有統計學意義（P<0.01，P<0.05）。見圖1 和表6。

4 討論

酒精濫用和酒精依賴是當前世界面臨的嚴重問題，而我國是全球酒精性肝損傷疾病人群最多的國家，嚴重危害了人民群眾的健康。研究表明，酒精性肝損傷的發病因素和病變程度與基因、性別以及飲酒時間長短等諸多因素有關，其發病機制也較為復雜。乙醇進入機體后，在肝臟乙醛脫氫酶的作用下生成乙醛，此生成的乙醛能夠通過激活肝臟中的一系列氧化酶系引起脂質過氧化而損傷肝臟細胞，使之造成肝臟脂質生成增加、脂滴積聚和慢性炎癥反應[8，9]。

本研究結果表明，長期酒精攝入能夠引起小鼠肝臟腫大，且伴隨著動物血清ALT、AST、ALP 含量和脂質代謝異常相關的TC、TG、LDL-c 顯著增加，HDL-c 明顯降低，表明酒精性肝損傷動物模型構建成功。對模型小鼠肝臟中炎癥因子TNF-α、HMGB-1、IL-6 表達水平檢測發現，造模后動物炎癥因子表達明顯增加，表明了酒精性肝損傷能夠導致肝臟炎癥的產生。

表6 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠肝臟脂滴空泡數的影響（，n=10）

表6 還原型谷胱甘肽片對酒精性肝損傷小鼠肝臟脂滴空泡數的影響（，n=10）

采用還原型谷胱甘肽片治療后，血清中ALT、AST、ALP 含量和脂質代謝異常相關的TC、TG、LDL-c 顯著降低，HDL-c 顯著增加，且其肝臟中的炎癥因子和表達水平均顯著降低，表明了還原性谷胱甘肽具有保護肝細胞、減少肝臟炎癥的作用。過去的研究多聚焦于酒精能夠增加肝臟氧化應激狀態，活性氧自由基（ROS）的大量產生是酒精導致肝臟炎癥損傷的重要機制，而忽略肝臟脂滴生成增加在肝臟損傷中的潛在作用。最新的研究表明，肝臟脂滴沉積[10]是脂肪肝的重要表現，嚴重影響肝臟功能，減少脂滴沉積是肝臟保護的手段和途徑，也是研究的重要課題。

本研究對肝臟病理學切片觀察發現，動物造模后，肝臟出現大量圓形脂滴孔空泡，而采用還原型谷胱甘肽片治療后，動物肝臟中的圓形脂滴孔空泡、脂滴沉積得以緩解，表明還原型谷胱甘肽片可能通過減少脂滴沉積、發揮保護和治療酒精性肝損傷的作用。

綜上所述，本研究創新性的發現還原型谷胱甘肽片可能通過減少肝臟脂滴生成以及抑制肝臟炎癥，發揮對小鼠酒精性肝損傷的保護作用。今后課題組將通過對肝臟中脂滴生成的相關信號通路進行研究，以期更深入地揭示還原型谷胱甘肽片保護酒精性肝損傷的作用機制。