氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除肝內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì)CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷大鼠門脈高壓的影響*

李 爽，劉金玉，武曉玉，王宏雅，劉慧萍，趙 欣，蔡大勇

門脈高壓(portal hypertension, PHT)是慢性肝病常見的并發(fā)癥，發(fā)病率和病死率高，缺乏特異性治療藥物[1,2]。門脈高壓的病機(jī)主要是肝臟纖維組織增生和再生小結(jié)導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)構(gòu)重塑，使肝內(nèi)門脈血流阻力增加。巨噬細(xì)胞廣泛分布于全身各組織[4]，在組織修復(fù)、代謝和免疫調(diào)節(jié)過程中起關(guān)鍵作用[5]。肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞主要有兩種，一種是肝臟固有的巨噬細(xì)胞，又稱為Kupffer細(xì)胞；另一種是外周募集而來的單核細(xì)胞所衍生的巨噬細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞活化與門靜脈壓力升高有關(guān)[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)建立門脈高壓大鼠模型，經(jīng)尾靜脈注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(clodronate liposomes,CL)清除肝內(nèi)巨噬細(xì)胞，觀察巨噬細(xì)胞對(duì)大鼠門脈高壓的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器 SPF級(jí)、雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量為200～240 g，購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司【實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào):SYXK(京)2013-0023，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(京)2016-0002】，充足飲食飲水(25℃±0.2℃，12 h光照:12 h黑暗)。橄欖油(批號(hào):20171017)、四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4，批號(hào):20170326)購于北京國藥集團(tuán)試劑有限公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS,bs-0162R)、兔抗CD163多克隆抗體(bs-2527R)購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；羊抗兔二抗(BA1003)，即用型兔抗IgG SABC-AP 試劑盒(SA1022)、DAB顯色試劑盒(AR1002)均購于武漢博士德生物工程有限公司；大鼠CD163分子ELISA檢測試劑盒購于北京永澤浩嘉生物技術(shù)發(fā)展有限公司；氯膦酸二鈉購于隨州佳科生物有限公司，磷脂酰膽堿(批號(hào):CL29132802)、膽固醇(批號(hào):CC29123217)購于北京酷來搏科技有限公司。BL-420F生理機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，SVC-2000VA單相全自動(dòng)交流穩(wěn)壓器(華通機(jī)電有限公司)，AE160型電子天平(METTLER TOLEDO公司)，Multiskan MK3酶標(biāo)儀[(芬蘭)熱電(上海)儀器有限公司]，MPS/P2型石蠟包埋機(jī)(德國SLEE醫(yī)療)，CUT6062型石蠟切片機(jī)(德國SLEE醫(yī)療)，KF-PRO-005數(shù)字病理掃描系統(tǒng)(寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司)，RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，DLSB-5/20型低溫冷卻循環(huán)泵(上海振捷有限公司)，90-5型磁力攪拌器(上海振榮科學(xué)儀器有限公司)，KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，HC-3618R型低溫高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 脂質(zhì)體制備 參照文獻(xiàn)制作CL和磷酸鹽緩沖液脂質(zhì)體(phosphate buffered solution liposomes, PL)[8]，準(zhǔn)備磷脂酰膽堿氯仿(100 mg/ml)和膽固醇氯仿溶液(10 mg/ml)，磷脂酰膽堿氯仿溶液-20℃避光保存。取5.4 ml磷脂酰膽堿氯仿溶液和5.0 ml膽固醇氯仿溶液于1000 ml圓底燒瓶，40℃低真空旋轉(zhuǎn)蒸餾除去氯仿，在圓底燒瓶內(nèi)壁形成均勻的乳白色磷脂薄膜。將磷脂薄膜分散在25 ml PBS中(制備PL，30 min)或0.7 M氯膦酸二鈉(制備CL，15 min)。室溫100 r/m離心。將乳白色混懸液室溫放置2 h，在水浴聲波震蕩器中震蕩25 min，室溫下保存2 h，使脂質(zhì)體膨脹。在22 000g，10℃離心60 min除去未被包裹的氯膦酸二鈉，使用無菌PBS清洗脂質(zhì)體3次。將沉淀脂質(zhì)體懸浮于PBS 10 ml中。檢測得到脂質(zhì)體粒徑為170～190 nm，包封率為5.4%。

1.3 動(dòng)物門脈高壓模型的制備 隨機(jī)將動(dòng)物分為對(duì)照組和模型組，每組24只。在對(duì)照組，給予橄欖油3 ml·kg-1皮下注射，2次/w；在模型組，給予40% CCl4/橄欖油3 ml·kg-1皮下注射，2次/w；在d70～105，將每組動(dòng)物再分為2個(gè)亞組，即巨噬細(xì)胞未清除組和清除組，分別在半數(shù)動(dòng)物經(jīng)尾靜脈注射PL 0.3 ml·kg-1，1次/w，在另一半數(shù)動(dòng)物經(jīng)尾靜脈注射CL 15 mg.kg-1，1次/w。在d105，處死動(dòng)物前禁食12 h，稱量體質(zhì)量(w，g)，觀察各組體質(zhì)量變化。將大鼠麻醉后，沿腹中線切口打開腹腔，暴露門靜脈主干，分離腸系膜前靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)離門靜脈的一端，用血管夾夾住近端，沿腸系膜上靜脈插入充滿肝素鈉的PE管至門靜脈正中，固定，連接壓力傳感器(成都泰盟科技有限公司)，使用BL-420F生理機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)測定大鼠肝臟在體門靜脈壓力[9]。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，灌注并固定，取出大鼠肝臟和脾臟，稱量質(zhì)量(wg/p，g)，按[(wg/p÷w)×100]×100%，計(jì)算每100 g體質(zhì)量的臟器指數(shù)。

1.4 組織病理學(xué)檢查 取大鼠左葉肝臟，常規(guī)石蠟包埋，3 μm切片，HE染色，使用數(shù)字病理掃描系統(tǒng)(寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司)獲取圖片，觀察大鼠肝臟病理學(xué)變化。在10倍物鏡下，隨機(jī)選擇每張切片5個(gè)視野，視野下總面積為1，計(jì)數(shù)肝小葉(假小葉)個(gè)數(shù)(n)，計(jì)算平均肝小葉面積比[S=1/n]，平均肝小葉體積比[V=S3/2]，以5個(gè)視野的平均值為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.5 肝功能和血清sCD163檢測 使用全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼)測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate amino transferase, AST)；采用ELISA法檢測血清sCD163水平。

1.6 肝組織蛋白檢測 采用sABC法檢測肝組織CD163和iNOS表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、臟器系數(shù)和門靜脈壓力比較 在PL和CL處理大鼠，模型組大鼠體質(zhì)量均顯著性輕于對(duì)照組(P<0.05)，模型組肝臟和脾臟指數(shù)顯著性大于對(duì)照組(P<0.05)；CL處理大鼠體質(zhì)量和脾臟指數(shù)顯著大于PL處理組(P<0.05)，肝臟指數(shù)顯著小于PL處理組(P<0.05)；CL處理組大鼠門靜脈壓力顯著低于PL處理組(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)和門靜脈壓力比較

與PL組比，①P<0.05

2.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化 見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，100×)A：PL處理對(duì)照組；B：PL處理模型組；C：CL處理對(duì)照組；D：CL處理模型組

2.3 各組大鼠血清指標(biāo)比較 在PL和CL處理大鼠，模型組血清ALT和AST水平均顯著性高于對(duì)照組(P<0.05)，CL處理大鼠ALT和AST水平均顯著低于PL處理大鼠(P<0.05)；CL處理大鼠血清sCD163水平顯著低于PL處理組(P<0.05，表2)。

2.4 各組大鼠肝組織蛋白表達(dá)情況 CD163陽性表達(dá)主要分布于肝小葉Kupffer 細(xì)胞和匯管區(qū)巨噬細(xì)胞；CL處理組大鼠CD163陽性表達(dá)量均較PL處理組大鼠有不同程度的減弱(圖2)；iNOS陽性表達(dá)在對(duì)照組大鼠主要分布于肝小葉Kupffer細(xì)胞，在模型組大鼠主要分布于匯管區(qū)巨噬細(xì)胞。CL處理組大鼠肝組織iNOS陽性表達(dá)量較PL處理組大鼠有不同程度的減弱(圖3)。

表2 各組大鼠肝小葉體積比和血清指標(biāo)比較

與PL組比，①P<0.05

圖2 各組大鼠肝組織CD163蛋白表達(dá)情況(sABC，200×) A：PL處理對(duì)照組；B：PL處理模型組；C：CL處理對(duì)照組；D：CL處理模型組

圖3 各組大鼠肝組織iNOS蛋白表達(dá)情況(sABC，200×) A：PL處理對(duì)照組；B：PL處理模型組；C：CL處理對(duì)照組；D：CL處理模型組

3 討論

肝臟正常組織結(jié)構(gòu)被破壞，一氧化氮(nitric oxide, NO)等舒張物質(zhì)活性降低，內(nèi)皮素等收縮物質(zhì)活性增高，導(dǎo)致門靜脈壓力升高。近期有研究表明，肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞過度活化參與門脈高壓進(jìn)展[8-10]。氯膦酸二鈉脂質(zhì)體被廣泛用于清除巨噬細(xì)胞，其主要作用機(jī)理為巨噬細(xì)胞將脂質(zhì)體吞噬后，氯膦酸二鈉釋放，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡[11-16]。本實(shí)驗(yàn)以CCl4誘導(dǎo)大鼠肝損傷復(fù)制門脈高壓模型，經(jīng)尾靜脈注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除大鼠肝臟巨噬細(xì)胞，PBS空白脂質(zhì)體作為對(duì)照，通過檢測肝臟病變、門脈壓力和CD163等指標(biāo)，觀察巨噬細(xì)胞對(duì)門脈高壓的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞清除與未清除大鼠比，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞清除組大鼠門靜脈壓力、肝臟病變、血清ALT、AST和sCD163水平均比巨噬細(xì)胞未清除組有顯著降低和改善。

CD163又稱血紅蛋白清道夫受體，是富含半胱氨酸的清道夫受體超家族中一員，其表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞，是巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志物。CD163在體內(nèi)有兩種存在方式:一種是以跨膜大分子的形式存在單核/巨噬細(xì)胞上；另一種sCD163是CD163的脫落形式，可溶于血清和多種組織液中，具有多種生物學(xué)功能[17]。在門脈高壓患者，血清sCD163水平升高，在臨床上作為門脈高壓預(yù)后的預(yù)測分子。本實(shí)驗(yàn)中，與PBS脂質(zhì)體模型組大鼠比較，氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞后，模型大鼠在體門靜脈壓力降低，血清sCD163水平和免疫組化檢測的CD163陽性表達(dá)均降低，以上結(jié)果提示巨噬細(xì)胞參與肝損傷大鼠門脈高壓的發(fā)生和發(fā)展[18-21]。巨噬細(xì)胞活化，過表達(dá)iNOS，iNOS催化L-精氨酸生成NO，NO與超氧陰離子反應(yīng)，形成過氧亞硝酸鹽，使NO的生物利用度降低，導(dǎo)致門靜收縮，壓力升高，進(jìn)而引起門脈高壓。本實(shí)驗(yàn)在巨噬細(xì)胞清除大鼠，肝組織iNOS陽性表達(dá)較未清除大鼠有不同程度的減弱。