肝硬化患者腸道微生態與肌量減少的相關性研究*

郝莎莎，任曉靜，原麗莉，姚 佳

肝硬化是一種由各種原因引起的慢性、進行性、彌漫性肝臟改變，常常伴有營養能量代謝改變，從而導致肌量減少或肌肉減少癥[1, 2]。肌量減少或肌肉減少癥是評估營養不良的指標，同時也是肝硬化患者預后不良的影響因素。人體腸道內存在數量龐大、結構復雜的菌群，彼此之間相互作用，相互制約，處于動態平衡狀態，直接參與人體的消化、營養吸收和能量供應等諸多方面[6]。前期我們在研究中發現肝硬化患者易發生小腸細菌過度生長，并且與患者的營養不良密切相關[7]。研究表明相對于健康人群，肝硬化患者的腸道菌群結構發生了改變。這些改變的腸道菌群是否影響肝硬化患者的營養狀況，目前尚無研究采用宏基因組學分析腸道菌群與營養狀況的關系。我們前期研究表明，第三腰椎骨骼肌指數(L3 skeletal muscle index，SMI)預測肝硬化并發腹水患者預后的價值優于傳統的營養評估方法，如體質指數(body mass index,BMI)，上臂肌圍(upper arm muscle circumference ,MAMC)和三頭肌皮褶厚度(triceps skinfold thickness,TSF) {Yao, 2019 #198}。因此，本研究采用L3 SMI評估了肝硬化患者肌量減少及其與腸道微生態的相關性，旨在為干預和提高肝硬化患者的營養狀況提供診療思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2019年4月～2019年10月山西白求恩醫院住院的肝硬化患者60例，男性36例，女性24例；平均年齡(53.5±12.4)歲。其中乙型肝炎肝硬化44例，丙型肝炎肝硬化6例，酒精性肝硬化6例，原發膽汁性肝硬化4例。根據臨床資料、血生化指標、影像學資料和肝組織病理學檢查等診斷為肝硬化。排除標準：①并發肝癌及其他惡性腫瘤；②并發嚴重的呼吸和循環系統疾??；③有胃腸道手術史。另選擇同期健康體檢者30例，男性17例，女性13例；平均年齡為(54.2±11.2)歲，無肝臟和胃腸道疾病史，無高血壓和糖尿病等慢性疾病。

1.2 營養狀況的評估 選擇第3腰椎間盤平面成像，應用影像分析軟件(syngo.via Siemens AG)計算第3腰椎平面骨骼肌的橫截面積總和，再除以身高的平方(cm2/m2)，即得到L3 SMI。L3 SMI是反映全身骨骼肌質量的重要指標。一些研究將其作為營養不良的診斷標準。我們采用日本肝病學會肌量減少診斷標準，即L3 SMI：女性<38 cm2/m2，男性<42 cm2/m2判定為肌量減少[10]。

1.3 糞便DNA提取 受檢者在4周內不應用抗生素或微生態制劑，排除消化道出血者。采集晨起新鮮糞便，置于無菌留便盒，3 h內轉入-80℃冰箱凍存。采用QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit，根據說明書提取糞便DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳(AGE)分析DNA的純度和完整性，采用Qubit精確定量DNA濃度。

1.4 宏基因組測序 根據文庫試劑盒[KAPA HyperPlus PCR-free(96rxn)]說明書進行操作。對檢測合格的DNA 樣品用Covaris超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350 bp的片段，經末端修復、加A 尾、加測序接頭、純化、PCR 擴增等步驟完成整個文庫制備。在文庫構建完成后，先使用Qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫至 2 ng/μl，使用普凱瑞qSep 100 對文庫的insert size進行檢測。當insert size符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>3 nM)，以保證文庫質量。在文庫檢測合格后，進行Illumina HiSeq測序。對所有原始宏基因組測序數據通過MOCAT2軟件進行質量質控[11]。對高質量的reads用SOAPdenovo(v2.04，參數：all -D 1 -M 3 -L 500，http://soap.genomics.org.cn) 進行組裝，得到scaftigs?；诮M裝獲得scaftigs，用MetaGeneMark進行基因結構預測。對預測后的基因用CD-HIT進行聚類去冗余。當兩個基因的序列大于 95%以上一致，并且重疊區域覆蓋超過其中短序列的90%以上時，將這兩個基因聚到一個簇中，選擇簇中最長的序列作為該簇的代表序列，構建基因長度大于100 bp的非冗余基因集；在基因層面上，將高質量reads通過BWA比對到所構建的非冗余參考基因集，去除長度小于30 bp以及一致性低于95%的reads，得到每個基因的reads計數，再經標準化處理，獲得基因的相對豐度。在物種及其他高級分類層面上，應用MetaPhlan 2.0獲得菌群的相對豐度。

2 結果

2.1 一般資料 健康人BMI為(24.8±4.1)kg/m2，顯著大于肝硬化組【(23.7±3.6)kg/m2，P<0.05】；根據L3 SMI指數，將肝硬化患者進一步分為肌量減少組和肌量正常組，匹配年齡和性別后，肌量減少組為24例，肌量正常組為36例，兩組臨床資料見表1。

2.2 腸道菌群Alpha多樣性分析 采用Shannon指數評估入組人員腸道菌群多樣性。肝硬化組Shannon指數為(2.3±0.8)，顯著低于健康人【(2.7±0.5)，P=0.086】；進一步分析，肌量減少組shannon指數為(2.1±0.8)，顯著低于肌量正常組【(2.7±0.8，P=0.048，圖1)。

表1 兩組肝硬化患者臨床資料比較

圖1 健康人與肝硬化患者腸道菌群多樣性分析

2.3 物種組成分析 在門水平，肝硬化患者糞便菌群中厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)仍是腸道菌群中的絕對優勢菌，其次是放線菌門(Actinobacteriap)、變形菌門(Proteobacteria)，占全部序列的99%以上。在健康人和肝硬化組，厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門相對豐度分別為57.1%±13.5%和47.9%±16.9%、14.8%±16.9%和8.3%±11.5%，和25.1%±9.2%和36.8%±21.2% (P>0.05)；變形菌門相對豐度為1.7%±1.5%和6.2%±7.9%(P<0.05，圖2)；在肌量減少組和肌量正常組，厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門相對豐度分別為43.8%±18.3%和54.5%±12.5%、8.7%±13.2%和7.6%±8.6%，和38.8%±24.6%和33.6%±14.8%(P>0.05)；變形菌門相對豐度為7.7%±9.3%和3.6%±4.1%(P<0.05，圖2)；為了分析肝硬化肌量減少組和肌量正常組患者腸道菌群的差異，我們應用非參數Kruskal-Wallis 秩和檢驗在種水平進行了分析，發現兩組之間存在16種相對豐度顯著差異的菌種(P<0.05)，其中肌量減少組中相對豐度顯著降低的是多形棒狀菌(Bacteroides uniforms)、梭桿菌(Clostridium_asparagiform)、毛螺菌 (Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA、Lachnospiraceae_bacterium_7_1_58FAA)、瘤胃球菌(Ruminococcus_flavefaciens)、韋榮球菌(Erysipelotrichaceae_bacterium_2_2_44A)、Granulicella_unclassified、Eggerthella_unclassified、Anaerostipes_hadrus，顯著增加的是真桿菌(Eubacterium_infirmum)、消化鏈球菌(Peptostreptococcus_stomatis)、隸屬于擬桿菌屬(Bacteroides)的Bacteroides_caccae、Bacteroides_coprocola、Bacteroides_faecis、Weissella_unclassified、Megamonas_unclassified(圖3)。進一步，我們把在種水平上有意義的腸道菌群與L3 SMI進行了關聯分析(圖4)，結果發現兩個種的細菌與SMI顯著相關，其中Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA(r=0.615，P<0.001)和Bacteroides uniforms(r=0.420，P<0.001)均與L3 SMI呈顯著正相關。

3 討論

本研究利用宏基因組測序方法分析了肌量減少的肝硬化患者的腸道菌群特點。我們發現，相似于既往的研究結果[12-14]，肝硬化患者衡量多樣性的shannon指數比健康人略有下降。在門水平，肌量減少的肝硬化患者變形菌門相對豐度明顯增高。在種水平，通過非參數Kruskal-Wallis 秩和檢驗，發現肌量減少組和肌量正常組之間存在16個菌種的差異，進一步通過關聯分析發現Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA和Bacteroides uniforms細菌相對豐度與SMI呈顯著正相關。

研究表明，與正常人相比，肝硬化患者腸道菌群發生了改變。這些變化的菌群不同程度地影響肝硬化患者的營養狀況[15]。本研究肌量減少組腸道菌群多樣性比肌量正常組下降，比健康人顯著下降，提示肌量減少與腸道菌群的多樣性相關。在某些病理狀態下腸道微環境可能更有利于某些適合的細菌過度生長，從而表現為多樣性下降[16]。相反，在肌肉發達的運動員中腸道菌群的多樣性增加。

圖2 健康人與肝硬化患者及肝硬化肌量減少組與肌量正常組在門水平菌群差異比較

圖3 肌量減少組與肌量正常組在種水平菌群相對豐度比較 種菌群相對豐度以對數標度繪制，方框表示從第一個四分位數到第三個四分位數的四分位數間距(IQR)，內線表示中位數。箱線表示從第一個和第三個四分位數開始的1.5 IQR范圍內的最低和最高值。圓代表箱線以外的異常值

圖4 肝硬化患者腸道菌群與L3 SMI的相關性分析

在種水平分析，我們發現肌量減少組和肌量正常組肝硬化患者腸道菌群的差異，兩組之間存在16種相對豐度明顯差異的菌種 (P<0.05)。進一步通過關聯分析發現Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA和Bacteroides uniforms與SMI顯著相關。Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FA屬于毛螺科菌(Lachnospiraceae)，是人類胃腸道微生物群的主要部分，主要用于膳食纖維的發酵，為機體產生有益的物質[18]。Lachnospiraceae菌群的成員與肥胖癥和人類結腸癌的預防有關，這主要是因為該菌群的許多成員與丁酸的產生有關[19, 20]，丁酸是一種短鏈脂肪酸，它的產生會阻止某些微生物在腸道中的生長，刺激產生調節性T細胞，抑制炎癥和調節基因表達，同時為機體提供了能量來源。Bacteroides uniforms屬于擬桿菌屬(Bacteroides)是人類腸道中的共生菌，可以廣泛利用飲食和內源性多糖，生產對細菌和宿主都有潛在益處的物質[21]。目前已知，在腸道中，Bacteroides對宿主是有益的[22]。纖維素和半纖維素等不能被胃消化酶直接消化的物質進入到結腸被Bacteroides發酵分解成短鏈脂肪酸，為機體供給能量[23]。研究表明，Bacteroides uniforms糖酵解能力高于其它Bacteroides species[21]。肌量減少組中Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA和Bacteroides uniforms相對豐度的降低，一方面與丁酸生成量的減少有關，一方面與炎癥打破腸黏膜免疫系統的動態平衡有關，兩者均影響機體營養物質的吸收，使機體SMI降低。