不穩定性心絞痛患者的血清蛋白質組學研究

不穩定性心絞痛是由于冠狀動脈不穩定性斑塊的破裂伴發血栓形成引起的急性心血管事件，不穩定斑塊的破裂是其發生、發展的病理生理基礎。如何篩選出與不穩定性心絞痛相關的特異性生物標志物，敏感性更高、特異性更強，是心血管專業所面臨的重大課題[1-2]。近年來蛋白質組學技術的飛速發展，為其提供了新的思路和技術平臺[3]。蛋白質組學是指一個生物體/組織/細胞所表達的整套蛋白質，是研究特定組織在不同時空情況下全部蛋白質表達和功能的技術，有助于尋找疾病診治的新標志物。血清標本的取材相對簡便，容易獲取，是較為理想的臨床樣本[4-7]，本研究以不穩定性心絞痛患者的血清為研究對象，希望能找出與之相關的特異蛋白質。

1 對象與方法

1.1 對象入選2018年1—11月在空軍特色醫學中心就診的患者，共200例，臨床懷疑冠心病（主要表現為異常心電圖、胸痛不適和/或心肌核素檢查異常），年齡45～75歲，所有患者行冠狀動脈造影檢查，依據冠狀動脈造影結果分為2組：造影陰性為正常對照組，冠狀動脈有不同程度狹窄為不穩定性心絞痛組，各100例。本研究獲得空軍特色醫學中心醫學倫理委員會批準，并向患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器ProteoExtract-Albumin/IgC Removal Kit購自德國Merck公司，Immobilized pH gradient IPG 4-7（17 cm）、immobilized pH gradient IPG 3-10（17 cm）購自美國Bio-Rad公司，Human SAA ELISA試劑盒、Human Gelsolin ELISA試劑盒購自美國Invitrogen公司，YM-3超濾膜購自美國Millipore公司，IPGphor等電聚焦儀購自美國GE公司，Ettan DALT Ⅵ垂直平板電泳系統、Typhoon 9410掃描儀購自美國Amersham Biosciences公司，ABI 4800 MALDI-TOF-MS質譜儀購自美國Applied Biosystcm公司。

1.3 方法應用雙向熒光差異凝膠電泳（2DEDIGE）和質譜分析技術，對不穩定性心絞痛及冠狀動脈正常人群各100例，行血清蛋白質組學研究，并選取2個具有代表性的差異蛋白應用ELISA進行驗證。血清標本的收集和處理純化、ELISA檢測急性期反應蛋白血清淀粉樣蛋白A2（SAA2）、凝溶膠蛋白（Gelsolin）的濃度均按照相關說明書操作。差異凝膠雙向電泳和質譜分析在蛋白質組學研究中心進行。

1.4 統計學處理應用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析，計量變量以±s表示，采用方差分析，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較2組患者在年齡、血壓、血糖、白細胞計數，是否合并糖尿病、高脂血癥，吸煙與否、阿司匹林、血管緊張素轉化酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥（ACEI/ARB）類藥物、β受體-阻斷藥應用比例等各方面比較差異無統計學意義；不穩定性心絞痛組的男性患者比對照組多，高敏C反應蛋白（high sensitive c-reactive protein，hs-CRP）水平及服用他汀類藥物比例明顯高于對照組，總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平低于對照組（表1）。

表1 2組懷疑冠心病患者的一般資料

圖1 不穩定性心絞痛組和對照組的差異表達蛋白譜的熒光重疊圖

2.2 差異蛋白質點的質譜分析用SDS-PAGE電泳圖比較原血漿和去除IgG和ALB的血漿，經過處理的樣品已除去高豐度蛋白。2-DE凝膠分別經過3個通道掃描（圖1），分析軟件為DeCyder6.5，對匹配蛋白質點的豐度進行差異比較，得到了32個差異有統計學意義（P＜0.05）蛋白質點，其中有19個點下調，13個點上調。利用制備膠分離蛋白樣品，經MALDI-TOF/TOF質譜分析，共鑒定到11種19個差異蛋白（表2），存在著翻譯后修飾的情況。SAA2、銅籃蛋白、α-1抗胰蛋白酶α-AT以及結合珠蛋白、補體系統的C4和C6前體發生上調。有載脂蛋白A-Ⅰ，ApoA-Ⅰ，ApoA-Ⅳ及其前體，轉鐵蛋白11 kD、7 kD，轉甲狀腺素蛋白，細胞骨架的凝溶膠蛋白、凝溶膠蛋白-1亞基、Myosin-11，血紅蛋白β鏈和11 kDa亞基下調（表2）。

表2 差異蛋白質的質譜鑒定結果

2.3 差異表達蛋白質的功能分析對鑒定的蛋白質進行分析顯示，差異蛋白質涉及到急性期反應、炎癥反應、細胞骨架、脂代謝和能量代謝等多種功能，其中急性期反應蛋白占28.1%、脂代謝蛋白占12.5%、補體系統蛋白占12.5%、細胞骨架蛋白占12.5%、能量代謝相關蛋白占16.7%、纖維蛋白占8.3%，其他功能未知蛋白占8.3%。

2.4 ELISA驗證雙向凝膠電泳的定量結果為驗證雙向凝膠電泳結果的可靠性，選取2個具有代表性的差異蛋白，急性期反應蛋白-血清淀粉樣蛋白A2（SAA2）和細胞骨架蛋白-凝溶膠蛋白（Gelsolin），并選取年齡和性別匹配的冠脈正常人（對照組）、穩定性心絞痛（穩定型心絞痛組）、不穩定性心絞痛（不穩定性心絞痛組）以及急性心肌梗死（急性心肌梗死組）患者各50例，應用ELISA進行。結果顯示，SAA2在冠狀動脈正常組和穩定心絞痛組患者中表達水平差異無統計學意義，不穩定性心絞痛組和急性心肌梗死組患者明顯高于對照組和穩定性心絞痛組（P＜0.01），其中急性心肌梗死組最高（圖2）。Gelsolin在對照組、穩定性心絞痛組、不穩定性心絞痛組和急性心肌梗死組中的表達水平逐漸減低，急性心肌梗死組最低（圖3）。

圖2 SAA2在血清中的表達

圖3 Gelsolin在血清中的表達

3 討論

本研究以不穩定性心絞痛患者的血清為研究對象，采用2DE-DIGE-MS方法分析差異蛋白質點，并應用ELISA進行驗證，結果發現11種19個差異蛋白質點，涉及到急性期反應、炎癥反應、細胞骨架、脂代謝和能量代謝等。

3.1 急性期反應蛋白SAA2、銅籃蛋白、α-1抗胰蛋白酶在不穩定性心絞痛中上調。SAA2屬于急性期蛋白，在機體遭受創傷、手術、感染、燒傷等應激時明顯升高，是反映體內炎癥的敏感指標。本研究結果顯示，急性冠狀動脈綜合征（ACS）時機體伴有明顯的急性期反應，SAA2上調，和既往文獻報道相一致[8]。銅籃蛋白是人體重要的亞鐵氧化酶，對鐵的轉運和平衡起著重要作用。研究證實，銅藍蛋白能夠促進體內氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的形成，在動脈硬化進展中起到一定的作用[9]。本研究結果顯示，不穩定性心絞痛患者銅籃蛋白升高，說明與其進展有關。α-AT是主要炎性反應蛋白之一，屬于蛋白酶抑制因子，在缺血再灌注損傷的急性期表達增高，已有多個研究報道α-AT和ACS密切相關[9]。

3.2 補體系統的C4和C6前體表達上調補體系統是由血清/組織液中的一組可溶性蛋白及存在于血細胞表面的膜結合蛋白和補體受體所組成，大量事實證明補體系統與動脈粥樣硬化的病理過程相關，可引起血小板聚集，脂質及組織氧化過程[10]。在本研究中，C4B和C6前體表達上調，說明炎癥反應可能參與了ACS的發生發展。

3.3 纖維蛋白升高纖維蛋白是體內重要的凝血因子，血漿纖維蛋白水平升高與動脈粥樣硬化嚴重程度密切相關，是冠心病的一個獨立危險因素，纖維蛋白升高提示機體凝血相關蛋白異常，易致血栓形成，促進不穩定性心絞痛的發生發展。

3.4 ApoA-Ⅰ、ApoA-Ⅳ及其前體表達下調ApoA-Ⅰ是高密度脂蛋白的主要蛋白成分，ApoA-Ⅰ降低是心肌梗死的獨立危險因素。ApoA-Ⅳ是一種脂結合蛋白，主要作用是參與脂質代謝，ApoA-Ⅳ通過介導HDL與肝細胞的結合以及被攝取，參與了膽固醇逆向轉運，具有抗動脈粥樣硬化作用[11]。本研究中不穩定性心絞痛患者載脂蛋白均下調，說明脂代謝紊亂在其發病中起到重要的作用。

3.5 轉鐵蛋白11 kD、7 kD下調轉鐵蛋白是由肝臟合成的一類結合球蛋白，主要生理作用是維持體內金屬離子穩態，抑制LDL氧化修飾，從而減輕動脈硬化發生發展[12]。本研究中轉鐵蛋白下調，說明轉鐵蛋白在ACS發病中可能起到一定的作用。

3.6 轉甲狀腺素蛋白下調轉鐵蛋白是一種急性期負相蛋白，在機體內起運輸營養物質、激素和代謝物等作用，本研究中轉甲狀腺素蛋白下調，說明ACS發生時可能伴有代謝失常。

3.7 組成細胞骨架Gelsolin、凝溶膠蛋白-1亞基下調凝溶膠蛋白是組成細胞骨架蛋白的重要成分之一，屬于肌動蛋白結合蛋白，其主要功能是切割肌動蛋白（actin），介導細胞外骨架重排，和粥樣斑塊的纖維帽厚薄有關。本研究顯示ACS患者Gelsolin下調，運用ELISA的方法進一步驗證，說明急性冠脈綜合征時凝溶膠蛋白下調，纖維帽變薄，進一步促進其發生發展。

綜上所述，本實驗采用血清蛋白質組學技術分析了不穩定性心絞痛發生發展過程中蛋白質表達譜的變化，通過對差異蛋白的生物學功能分析，發現急性期反應蛋白、補體系統及凝血相關蛋白的異常，載脂蛋白、細胞骨架蛋白的降低，能量代謝紊亂等一系列的病理生理改變參與不穩定性心絞痛的進展。發現了某些特異表達蛋白質的改變，特別是細胞骨架蛋白，如凝溶膠蛋白的改變，尚未見相關報道，可能為心絞痛的防治提供新靶點，雖然進行了小樣本量的ELISA驗證，但尚需進一步實驗研究和大規模臨床驗證。