豬偽狂犬病毒TK基因的擴增及序列分析

林 鷙，何錫忠，潘 潔，朱永軍，彭麗英

(上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106)

豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的急性傳染病，臨床特征為動物發(fā)熱、奇癢及繁殖障礙，成年豬隱性感染從而造成長期帶毒排毒等[1]。PRV基因組為GC含量高達70%以上的線狀雙鏈DNA，編碼100多種蛋白。TK基因是豬偽狂犬病毒復制增殖的非必需基因，同時也是主要的毒力基因，對PRV毒力的影響最大，其編碼的胸苷激酶參與病毒的復制和潛伏感染，對病毒在神經(jīng)組織中的增殖具有重要作用[2-4]。

2011年以來，我國暴發(fā)了一種由豬偽狂犬病毒變異毒株引起的豬偽狂犬病，主要造成母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡。接種傳統(tǒng)的偽狂犬病疫苗已不能抵御偽狂犬病毒變異毒株的侵襲[5-6]。不同學者在不同的地區(qū)都分離到了流行的變異毒株[7-10]。本實驗室也從發(fā)病豬腦中分離到了一株豬偽狂犬病毒，并命名為SX株，本試驗擬利用PCR對該毒株的TK基因進行擴增和測序，并與國內(nèi)外經(jīng)典毒株、疫苗毒株以及近些年的變異毒株進行序列比對，以期了解豬偽狂犬流行變異毒株TK基因的結構特征及分子流行病學特點。

1 材料與方法

1.1 種毒、細胞

豬偽狂犬病毒SX株由上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所分離所得。ST細胞由上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.2 主要試驗試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Ex Taq DNA 聚合酶、DL5000 DNA Marker等均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物設計

根據(jù)GenBank上已公布的序列設計針對TK基因的特異性引物，上游引物F：GCACCCCGAGGTTGACTTCA；下游引物R：AGGGTCACACCCCCATCTCC。擴增片段大小預計為1 125bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 PRV DNA提取與PCR擴增

收集病變達到80%以上的ST細胞，反復凍融3次，12 000r/min離心后，取200 μL上清，利用試劑盒提取病毒DNA。利用1.3節(jié)的引物擴增PRV的TK基因。PCR反應體系：病毒DNA模板 2 μL，PCR mix 25 μL，上游引物F 2.5 μL，下游引物R 2.5 μL，ddH2O 18 μL，總體積50 μL。反應程序：95 ℃ 變性5 min； 95 ℃ 60 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.5 序列分析

采用DNAStar軟件將測序得到的SX株TK基因核苷酸序列及推導出的氨基酸序列與GenBank上9株國內(nèi)外PRV分離株的相應序列進行同源性比對分析和進化樹分析。9株國內(nèi)外分離株分別為來自中國的變異毒株HeN1株、JS2012株、TJ株、GD株、經(jīng)典毒株Ea株，匈牙利的Kaplan株和疫苗毒株Bartha株，美國的Becker株以及希臘的Kolchis株。

2 結果與分析

2.1 PRV TK基因的擴增

用設計的特異性引物進行PCR擴增之后，產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上有一條特異性的條帶，約1 100bp(圖1)，大小與預期結果相符。

2.2 PRV TK基因核苷酸序列分析

PCR產(chǎn)物測序顯示，目的片段包括了TK基因的編碼區(qū)序列，長度為963bp，共編碼320個氨基酸。將得到的序列結果與GenBank中已知的其他毒株TK基因核苷酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)(圖2)，SX株的TK基因序列與近些年國內(nèi)分離得到的流行毒株TK基因序列同源性為100%；與經(jīng)典毒株Ea株的同源性為99.6%，存在4個堿基的變異，分別為：第13位由A突變?yōu)镃，第643位和第644位由A和C突變?yōu)镚和T，第851位由C突變?yōu)門(圖3)；與疫苗毒株Bartha株的同源性為99.7%，存在以下變異：第643位和第644位堿基由A和C分別突變?yōu)镚和T，第851位堿基由C突變?yōu)門(圖3)；與國外的Becker、Kaplan、Kolchis毒株的同源性分別為99.6%，99.7%和99.4%。與Becker毒株的同源性和Ea株相同；與Kaplan毒株相比存在3個堿基的變異：第57位T突變?yōu)镚，第643和第644位由A和C突變?yōu)镚和T；與Kolchis毒株相比存在5個堿基的突變：第163位G突變?yōu)锳，第513位A突變?yōu)镚，第643位和第644位由A和C突變?yōu)镚和T，第810位A突變?yōu)镚(圖3)。

2.3 PRV TK基因編碼的氨基酸序列分析

結果顯示(圖4)：SX株TK基因編碼的氨基酸與近幾年分離得到的流行毒株的TK基因編碼的氨基酸同源性為100%。與國內(nèi)經(jīng)典毒株Ea株TK基因編碼的氨基酸同源性為99.4%，存在2個氨基酸的突變(圖5)：第215位的蘇氨酸(T)突變?yōu)槔i氨酸(V)，第284位的丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V)；與國外毒株TK基因編碼的氨基酸同源性為99.1%—99.7%；與Bartha株、Becker株相比存在2個氨基酸的突變：第215位的蘇氨酸(T)突變?yōu)槔i氨酸(V)，第284位的丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V)；與Kaplan株相比只存在1個氨基酸的突變，即第215位的蘇氨酸(T)突變?yōu)槔i氨酸(V)；與Kolchis株相比存在3個氨基酸的突變(圖5)：第55位的丙氨酸(A)突變?yōu)樘K氨酸(T)，第215位的蘇氨酸(T)突變?yōu)槔i氨酸(V)，第293位蘇氨酸(T)突變?yōu)楸彼?A)。

利用DNAstar軟件繪制進化樹，從圖6可看出，SX株與近些年國內(nèi)分離得到的流行變異毒株在一個分支上，與國內(nèi)經(jīng)典毒株Ea株、疫苗株Bartha株以及國外其他毒株呈現(xiàn)各自獨立的遺傳進化分支。

3 討論與結論

已有研究表明，TK基因?qū)儆赑RV的早期基因，也是主要的毒力基因，TK基因雖然是PRV復制的非必需基因，但是對病毒在神經(jīng)組織中的增殖具有重要作用。缺失了TK基因的病毒很難在神經(jīng)元中增殖，同時也降低了病毒的嗜神經(jīng)毒性和毒力[2-4]。因此，對TK基因的序列進行比對分析，在某種程度上可以反映出PRV的毒力強弱，有助于在分子水平上分析PRV 致病的分子機理。

本試驗參考GenBank中已知的PRVTK基因及相近的序列，設計特異性引物擴增了TK基因的全長，測序顯示TK基因的編碼區(qū)為963個堿基，編碼320個氨基酸。與國內(nèi)外不同毒株比對顯示，SX株TK基因序列與近些年分離到的變異毒株(HeN1、JS2012、TJ、GD)核苷酸和氨基酸均完全一致，同源性為100%；與國內(nèi)經(jīng)典毒株Ea株核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.6%和99.4%；與國外的毒株(Bartha、Becker、Kaplan、Kolchis)核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.4%—99.7%和99.1%—99.7%。對比近些年國內(nèi)流行的變異毒株TK基因與國內(nèi)經(jīng)典毒株及國外毒株TK基因氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，存在的突變位點雖然不多，但是大部分都出現(xiàn)了第215位由蘇氨酸(T)突變?yōu)槔i氨酸(V)和第284位由丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V)，這兩個位點值得注意，可能這兩個位點的突變是目前國內(nèi)流行的變異毒株TK基因重要的分子特征之一。此外，TK基因有2個非常重要的結構域，即ATP結合結構域和核苷酸結合結構域，分別位于10—18位和108—110位[12]，這些核心區(qū)域都沒有發(fā)生突變。由此可以看出，不管是核苷酸序列還是氨基酸序列，不同毒株之間存在一定的變異，但是同源性還是很高的，說明PRVTK基因具有較高的保守性。

本試驗對PRV SX株的TK基因分子特征進行了初步的分析，可以為PRV分子流行病學調(diào)查、TK基因的功能研究及病毒基因組改造等提供參考。