分子標記輔助選擇改良‘黃華占’的褐飛虱抗性與抗旱性

王飛名，孔德艷，劉國蘭，劉 毅，余新橋,2，畢俊國，羅利軍，張安寧*

(1上海市農業生物基因中心,上海201106；2上海市農業科學院莊行綜合試驗站,上海201415)

稻褐飛虱(Brown planthopper，BPH)是世界稻區主要水稻害蟲之一，為單食性害蟲，僅以水稻和普通野生稻為食及繁殖后代。褐飛虱是一種典型的刺吸式害蟲，靠吸食水稻韌皮部汁液為生，為害較輕時導致水稻營養物質運輸受阻，影響千粒重[1]；嚴重時造成水稻減產，甚至絕收[2]。目前，防控褐飛虱主要還是依賴于化學方法防治，不僅費時費工，而且對環境有害。生產實踐表明，選育褐飛虱抗性水稻品種是控制褐飛虱危害的資源節約與環境友好的方法[3]。

分子標記輔助選擇(MAS)能夠快速而精確地選擇目標基因，是一種導入有利基因進行遺傳改良的有效方法[4]。Bph14和Bph15 是水稻中2個主效抗褐飛虱基因，分別定位于第3和第4染色體上,分別解釋24%和16%的遺傳變異[5]。李進波等[6]將來源于水稻品系B5 的抗性基因Bph15導入到‘93-11’等秈稻品種中，發現含有抗性基因的材料抗性較高，表明Bph15基因可以達到增強水稻褐飛虱抗性的目的。

我國稻田中65%以上為中低產田，其中干旱是最主要的產量限制因子之一。由于雨量在季節上分布不平衡,旱災在長江流域、華南等稻區的發生較為頻繁，一旦發生干旱，水稻將大幅減產。 培育和推廣節水抗旱稻新品種,對于穩定和提高中低產田的產量水平具有重要意義。節水抗旱稻是指既具有水稻的高產優質特性、又具有旱稻的節水抗旱特性的一種新的水稻品種類型(農業行業標準NY/T 2862—2015)。在灌溉條件下，節水抗旱稻的產量、米質與普通水稻基本持平，但可節水50%以上；在望天田，其具有較好的抵抗干旱能力(或基本具有旱稻品種的抗旱能力)；在栽培上，簡單易行，投入低，節能環保[7]。筆者所在團隊通過水稻與旱稻資源的雜交，培育出了全球首例節水抗旱稻三系不育系滬旱1A[8]，并實現節水抗旱雜交稻三系配套；通過常規育種手段已培育出一批節水抗旱稻新品種并應用于生產，表現出明顯的節水抗旱特性，目前已有‘滬旱15’‘旱優73’‘旱優113’和‘旱優3號’等多個品種通過審定，并且在安徽、湖北、廣西等地大面積推廣應用[9-11]。

作物抗旱性狀比較復雜，涉及大量功能基因及其轉錄調控機制，單個基因的轉移通常難以獲得理想的效果。 常規育種往往利用抗旱性強的旱稻資源材料與高產優質的水稻品種雜交，在嚴格的水分脅迫條件下對分離世代的材料進行篩選，這種自然的選擇壓促使了抗旱相關基因的聚合[7]。

‘黃華占’是廣東省農業科學院水稻所培育的優良常規稻品種，先后通過廣東、湖北、湖南、海南、廣西、浙江、重慶、陜西等省(市)審定。該品種生育期適中，抗倒性強，高產穩產，米質優[12]，適合直播，深受種植大戶喜愛。以‘黃華占’為親本，衍生了多個品種通過審定[13]。但筆者多年鑒定發現，其抗旱性與褐飛虱抗性較差。本研究擬以抗旱性好且攜帶褐飛虱抗性基因Bph15的節水抗旱稻材料M535(其系譜為：‘滬旱15’//滬旱1B/B5)為供體材料，以‘黃華占’為受體材料，通過雜交、回交和分子標記輔助選擇，并進行嚴格的水分脅迫篩選，將Bph15基因與抗旱性導入到‘黃華占’背景中，旨在培育具有褐飛虱抗性與抗旱性的新品系。

1 材料與方法

1.1 抗性株系的選育方法

于2012—2016年進行選育，所有田間試驗材料種植在上海市農業科學院莊行綜合試驗站以及海南陵水試驗基地，分子標記檢測在上海市農業生物基因中心實驗室實施。以M535為供體親本，以‘黃華占’為受體親本，雜交后回交一次。對種植的30個BC1F1單株使用與Bph15連鎖的分子標記Ms5進行目標基因檢測，篩選出16株Bph15基因雜合單株，然后繼續與‘黃華占’回交，得到BC2F1的種子，在30株BC2F1中取葉片進行分子標記篩選，檢測出含有Bph15基因的雜合單株17株，選擇與‘黃華占’田間農藝性狀相似的6個單株。混收6個單株，種植2 000株于旱地進行抗旱性初篩，分子標記檢測選擇Bph15基因的純合單株并進行表型鑒定選擇，獲得表型與‘黃華占’相似的12個單株。混收12個單株并種植200株BC2F3于旱地進行抗旱性復篩，此后再進行兩輪抗旱性復篩，篩選出3株抗旱性明顯提高，含有Bph15純合基因，且表型與‘黃華占’相似的單株(BC2F5)，用于后續研究(圖1)。

分子標記Ms5的引物正反序列分別為5’-TTGTGGGTCCCATCTCCTC-3’、5’-TGACAACTTGTGCAA-GATCAAA-3’[6]。采集水稻材料幼嫩葉片，用CTAB法快速提取DNA，PCR擴增體系參照樓巧君等[14]的方法。擴增產物在6%聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)上電泳，經銀染法顯帶后檢測。

1.2 遺傳背景分析

2017年7月采集3個改良株系以及供體親本M535、受體親本‘黃華占’的葉片，委托華智水稻生物技術有限公司，利用56K水稻全基因組SNP芯片檢測基因組差異，并計算遺傳背景回復率[15]。

1.3 褐飛虱苗期鑒定方法

分別于2015年與2016年6—9月在江西省農業科學院農業應用微生物研究所進行褐飛虱抗性鑒定。采用國際標準苗期群體篩選法(SSST法)進行[16]，水稻浸種催芽后播種在鑒定圃水泥池內，每份材料設3個重復，每重復20株左右，播種4 d后定苗，每重復保留秧苗15株，在秧苗2—3葉期時按照每株褐飛虱2—3齡若蟲5—7頭的量進行接蟲。苗期抗性評價參照IRRI[17]與陶林勇等[18]的方法進行。當感蟲對照品種‘TN1’死苗率達到95%左右時按照表1標準進行調查。

表1 水稻苗期褐飛虱抗性分級標準

1.4 抗旱性及主要農藝性狀考察

試驗于2016年5—10月在上海市農業科學院莊行試驗站的抗旱鑒定試驗區進行；試驗地前茬為大麥，土壤質地為壤土，土地較肥沃且地力均勻。

試驗材料為3個改良株系以及輪回親本‘黃華占’，抗旱對照品種為‘滬旱3號’。

參照中華人民共和國農業行業標準《NY/T 2863—2015節水抗旱稻抗旱性鑒定技術規范》進行抗旱性鑒定。將試驗材料分別種植于抗旱鑒定島(旱地)與抗旱鑒定島旁邊的水田，旱地與水田均采取直播方式種植，5月25日播種，穴播株行距為20cm×20cm，每穴點播3粒種子，小區大小為10穴/行×12行；6月10日間苗一次，密度為1株/穴。記載生育期，成熟期時兩種處理各取第3行的第3、4、5穴進行考種，水田考察株高、穗長、有效穗數、每穗總粒數、結實率、千粒重、單株重，旱地考察單株重，計算抗旱指數。各小區實收并折算成標準含水量下的單產。

數據錄入與統計分析分別利用Excel 2007及SPSS 19.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 MAS與抗旱性篩選及目標株系的獲得

2012年在上海配制F1雜交種，以后每年分別在海南與上海進行回交與自交。圖2A為2014年在上海用分子標記Ms5篩選BC2F2代群體單株分子檢測的部分結果，可以看出：分子標記Ms5在兩個親本P1與P2間表現出良好的多態性，雜合單株同時含有父本(M535)、母本(‘黃華占’)雙親的雙條帶，陽性純合單株只有與M535相同的單條帶，陰性純合單株只有與‘黃華占’相同的單條帶。通過分子標記輔助選擇和田間農藝性狀觀察，獲得了導入純合Bph15基因且田間農藝性狀與受體‘黃華占’相似的3個單株，編號分別為W1、W2、W3。2015年在上海種植BC2F4代株系并進行分子標記檢測，每個株系檢測13株。從圖2B可知，所有的單株與供體親本M535的帶型相同，表明獲得的目標株系均導入了純合的Bph15基因。

2.2 改良株系的遺傳背景分析

利用56K水稻全基因組SNP 芯片分析了3個改良株系的遺傳背景。從56 000個SNP中挑選33 782個SNP分析受體親本‘黃華占’與供體親本M535的基因型差異，結果表明：兩個親本有差異的SNP總數為13 543個。3個改良株系W1、W2、W3的背景回復率分別為92.01%、88.18%和84.26%(圖3)。

2.3 改良株系的苗期褐飛虱抗性鑒定

2015—2016年在江西省農業科學院農業應用微生物研究所，以受體親本‘黃華占’、供體親本M535、感蟲品種‘TN1’為對照，對3個株系W1、W2、W3進行褐飛虱抗性鑒定。鑒定結果表明，對照品種‘TN1’兩年中均表現高感，而供體親本M535在兩年均表現抗蟲(表2)。3個株系W1、W2和W3也表現抗褐飛虱(3級)。受體親本‘黃華占’兩年的抗性級別分別為高感(2015年)與感蟲(2016年)。

表2 目標改良株系對褐飛虱苗期抗性鑒定結果

注：數據為平均值±標準差，下同

2.4 改良株系的產量、主要農藝性狀及抗旱性表現

在正常水分栽培管理下，3個改良株系的生育期與‘黃華占’一致，均為125 d。實測產量及8個主要農藝性狀的比較分析結果(表3)表明，3個株系的產量、每穗總粒數、每穗實粒數、有效穗數、結實率等與‘黃華占’均沒有顯著差異。株系W2的穗長比‘黃華占’顯著增長，其他2個株系的穗長與‘黃華占’無顯著差異。株系W3的千粒重比‘黃華占’重，達到極顯著水平，其他2個株系與‘黃華占’無顯著差異。3個株系的株高均與‘黃華占’有極顯著差異，且3個株系之間也有顯著差異。

表3 目標改良株系與‘黃華占’的主要農藝性狀比較

注：不同大小寫字母分別表示同列數據在0.01或0.05水平上差異顯著

抗旱鑒定結果(表4)表明，3個株系的旱地單株產量均比‘黃華占’高。3個株系的抗旱性級別均達到3級以上，其中W1、W3抗旱性級別達到2級，而‘黃華占’的抗旱性級別為4級。

表4 目標改良株系與‘黃華占’的抗旱性比較

3 結論與討論

本研究結合分子標記輔助選擇和常規育種方法，將褐飛虱抗性基因Bph15導入到優良常規稻‘黃華占’中，并通過抗旱性篩選與鑒定，獲得3個既抗褐飛虱又抗旱且農藝性狀優良的品系，為節水抗旱稻育種提供了重要的中間材料。基于MAS方法改良水稻抗病、抗蟲性狀已有一些成功的例子，但分子標記輔助選擇在提高水稻的抗旱性上，特別是褐飛虱抗性與抗旱性聚合后的基因效應及其在水稻育種上的應用鮮有報道。

傳統的水稻抗褐飛虱育種，主要是利用抗褐飛虱品種與改良親本進行雜交，在分離世代進行多次褐飛虱抗性篩選，以期選育抗褐飛虱品種。但是褐飛虱鑒定需要人工養殖足夠的蟲源，費時費力，并且鑒定的結果受環境的影響較大，可能會入選抗性不好的假陽性單株。分子標記輔助育種技術不受這些限制，利用分子標記在低世代中鑒定導入純合褐飛虱抗性基因的單株，提高了育種效率和準確性。本研究通過1次雜交和2次回交，結合分子標記輔助選擇和田間表型篩選，選育出抗性與供體親本一致的3個株系，僅用4年時間，明顯提高了改良的效率。利用水稻育種芯片分析了3個改良株系的遺傳背景，3個改良株系的背景回復率均高于80%，說明連續表型鑒定對于選擇高背景回復率具有明顯的效果。本研究選育出的3個株系，其褐飛虱抗性水平與供體M535一致，且鑒定結果連續兩年穩定一致，可以確定W1、W2、W3可作為優良的褐飛虱抗性資源。但是，本研究選育的3個株系其褐飛虱抗性均未達到高抗及以上的程度，這可能是因為只導入了1個抗性基因Bph15。李進波等[3]研究發現，導入2個抗性基因的材料比含有單個抗性基因以及沒有抗性基因的材料抗性高，表明基因聚合可以達到增強水稻褐飛虱抗性的目的。接下來的研究將在選育的株系中繼續導入其他褐飛虱抗性基因，進一步提高其抗性水平。

本研究所用的供體親本M535，其系譜來源為‘滬旱15’//滬旱1B/B5，其遺傳組成上除了褐飛虱抗性材料B5，還有節水抗旱稻品種(系)‘滬旱15’與滬旱1B。本研究通過雜交技術，將‘滬旱15’與滬旱1B的抗旱相關基因導入輪回親本中，通過4輪嚴格的水分脅迫篩選，促使了抗旱相關基因的聚合并進行抗旱性表達[7]，取得顯著的效果。本研究選育的3個株系，其抗旱性明顯優于輪回親本‘黃華占’，W1、W3的抗旱級別甚至達到2級，與抗旱對照品種‘滬旱3號’抗旱性一致，可以認為W1、W2、W3可作為優良的抗旱性資源。

本研究表明，3個改良株系與‘黃華占’在產量、生育期上基本一致，除了株高增高外，其他主要農藝性狀也基本一致。因此，可以認為3個株系W1、W2、W3可以作為‘黃華占’的抗旱性、褐飛虱抗性改良系。但本試驗沒有涉及到3個改良株系的稻米品質表現以及生態適應性表現，尚需進一步研究。