寵物犬腸道可培養細菌耐藥性種類及其分布

Hafeez ul Haq 張沁怡 黎燁 陳明波 薛海曌 羅成松 方行 劉平平 蔣寧成 張婷 熊娟 田寶玉

摘?要：為探明寵物犬腸道微生物攜帶抗生素耐藥性的流行病學及闡釋飼養動物中微生物抗性與人病原微生物抗性基因的關系。采用細菌分離培養鑒定以及影印平板技術對寵物犬腸道可培養腸桿菌攜帶的耐藥性及其種類、多樣性和生態分布進行了調查。結果表明：寵物犬腸道可培養細菌具有較高的耐藥性比例和多重耐藥性。其中大腸桿菌對氨芐西林、磺胺類藥物、氯霉素、鏈霉素和四環素等較早使用的藥物耐藥率較高，反而對進入臨床時間較短的頭孢菌素類藥物相對較敏感。在調查的細菌中幾乎所有的細菌至少有1種抗生素抗性，可分離的腸道細菌中一半以上具有5種以上的抗生素抗性。綜上所述，腸道微生物抗性的產生與抗生素的使用時間緊密相關，并且寵物犬腸道可培養細菌的抗性廣泛分布，表明寵物很可能成為耐藥性基因在環境和人類病原細菌間傳播的潛在途徑。

關鍵詞：寵物犬;抗生素;腸道可培養細菌;耐藥性

中圖分類號：S858.292?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）04-0009-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.04.002

Types and Distribution of the Drug Resistance of the Culturable Bacteriain the Intestinal Tract of Pet Dogs

Hafeez ul Haq， ZHANG Qin?yi， LI Ye， CHEN Ming?bo， XUE Hai?zhao， LUO Cheng?song， FANG Xing，LIU Ping?ping， JIANG Ning?cheng， ZHANG Ting， XIONG Juan， TIAN Bao?yu*

（Engineering Research Center of Industrial Microbiology of Ministry of Education， Fujian Normal

University/College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： In order to explore the epidemiology of antibiotics resistance carried by pet dogs′ intestinal microorganisms and explain the relationship between the microbial resistance in raising animals and the resistance genes of human pathogenic microorganism， the antibiotic resistance carried by the culturable enterobacter in the intestinal tract of pet dogs was investigated， as well as the species， diversity and ecological distribution， by using the bacterial culture， isolation and identification and the replica plating technology. The results showed that the culturable bacteria in the intestinal tract of pet dogs had a high proportion of drug resistance and multi?drug resistance. Among which， Escherichia coli had a higher drug resistance rate to the drugs that were used earlier such as ampicillin， sulfonamides， chloramphenicol， streptomycin and tetracycline， while was more sensitive to cephalosporins with a short clinical time. Almost all of the bacteria surveyed had at least one antibiotic resistance， and more than half of the isolatable intestinal bacteria had at least five antibiotic resistance. In summary， the occurrence of intestinal microbial resistance was closely related to the usage time of antibiotics， and the wide distribution of the resistance of the culturable bacteria in the intestinal tract of pet dogs indicated that pets were likely to be the potential route for the transmission of resistance genes between the environment and human pathogenic bacteria.

Key words： Pet dogs; Antibiotics; Culturable intestinal bacteria; Drug resistance

自20世紀50年代Moore和Jukes等報道在畜禽和豬飼料中添加抗生素可以促進動物生長，提高生產效率以來，抗生素飼料生長促進劑的推廣和使用極大地促進了畜牧業的發展，使規模化工廠化養殖成為可能。抗生素的研發已經不只是為了治療人畜感染，越來越多的抗生素被用作飼料添加劑[1]。然而隨著越來越多的抗生素在醫療保健及畜牧業生產上的廣泛應用，抗生素使用導致的細菌耐藥性、禽畜產品藥物殘留等危害日益嚴重。一方面，新型抗生素研發和產生的速度總是跟不上細菌變異耐藥的速度。無論是臨床醫療還是畜牧業，都將面臨細菌耐藥性越來越強的問題。青霉素于1940年首次應用于臨床，14年后（1954年）金黃色葡萄球菌被證實對其產生了耐藥;同樣耐甲氧西林金黃色葡萄球菌出現于甲氧西林上市8年后的1968年;而慶大霉素于1964年投入使用，4年后亦出現了耐慶大霉素綠膿桿菌[2]。另一方面，抗生素進入到動物體內之后不能被完全吸收，有60%～90%的藥物隨動物糞便排出體外。這些殘余的抗生素會隨著動物糞便施肥過程釋放到環境中，并最終成為抗性細菌和多重抗性細菌的選擇因子和多重抗性因子。隨著抗生素的不斷研發和使用，各種耐藥菌伴隨而來，于是出現了“超級細菌”。所謂“超級細菌”并不是一種細菌的名稱，而是一類對絕大多數抗生素都有強耐藥性的細菌的統稱。它們能夠編碼新德里金屬?β?內酰胺酶（New Delhi metallo?beta?lactamase，簡稱NDM1），這是一種能催化水解多種β?內酰胺類抗生素（包括碳青霉烯類廣譜抗生素等抗生素）的酶[3]。針對NDM1，世界衛生組織（WHO）曾做出評估：雖然多重耐藥細菌并不屬于一個新問題，并且今后也還會繼續出現，但NDM1細菌的出現，表明細菌耐藥性已成為一個日益嚴重的全球性公共衛生問題。

目前，在所有消費的抗生素中，有50%用于畜牧業和水產養殖業，其中將近一半用于動物生長促進劑[4]。現在我國大約有17種抗生素被用作添加劑進入飼料中[5]。此類濫用抗生素的手段，是導致越來越多耐藥性細菌甚至超級細菌出現的一大原因。并且有關數據表明，近10年來，禽畜養殖中使用的抗生素劑量和種類一直在增加。禽畜糞肥也成為環境中抗性細菌和抗生素混合存在的一個重要的庫，由于其在農業土壤肥力保持中的重要作用，因而很大程度上提高了抗性基因和抗性細菌在土壤中的選擇和傳播過程[6]。由此可見，研究動物源性耐藥菌的產生不僅僅對動物生長具有重要意義，對人類的健康更具有重要作用。近年來，隨著中國經濟的快速增長和人民生活水平的提高，寵物行業得以高速發展，寵物越來越受到人們的青睞，家庭擁有的寵物總量以幾何倍數增長。2013年中國寵物數量已增至1.2億只，隨之而來的寵物食品市場快速發展，寵物養殖正逐漸向規模化和專業化方向發展[7]。與寵物數量快速增加所帶來的對公共安全危害和寄生蟲病傳播的廣泛關注不同，由于寵物和家庭成員的親密接觸，因此存在具有對抗生素抗性的微生物轉移至人類身上的可能。基于目前抗生素濫用情況的出現，本研究應用細菌分離培養鑒定以及影印平板技術，對目前市場上主要的寵物犬腸道內可培養微生物的抗生素抗性及其種類、多樣性和生態分布進行系統調查，以期探明寵物犬腸道微生物攜帶抗生素耐藥性的流行病學及闡釋飼養動物中微生物抗性與人類病原微生物抗性基因的關系等，為合理利用抗生素調節環境微生物的種類、數量以及抗生素抗性的分布奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

寵物犬的新鮮糞便收集于福州市花鳥市場寵物市場。采集新鮮糞便（3～5份）分別用密封袋密封，并用記號筆標記采集地點、采集日期、采集人，放入4℃的冰箱中備用。采集的樣品在24 h內處理。

1.2?培養基

1.2.1?液體培養基?LB液體培養基，胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g， NaCl 10 g， pH值自然，以蒸餾水定容至1 L， 1×105 Pa滅菌20 min備用。

1.2.2?固體培養基?LB固體培養基，胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g， NaCl 10 g，瓊脂粉15 g，pH值自然，以蒸餾水定容至1 L， 1×105 Pa滅菌20 min備用。

1.3?抗生素儲備液的制備

參照文獻[9]準備10類抗生素制成儲備液，過濾除菌后于-20℃冰箱保存備用。

1.3?試驗方法

1.3.1?樣品處理?將收集的新鮮寵物犬糞便稱取5 g，放入帶有3～5粒玻璃珠并盛有25 mL無菌生理鹽水的50 mL離心管中，用渦旋攪拌儀旋轉振蕩使糞便與無菌生理鹽水充分混勻。靜置5 min后分別移取1.0 mL糞便上清液梯度稀釋至10-4，分別吸取100 uL涂布于LB固體平板培養基上，每份糞便樣品至少涂布5個LB平板，37℃培養24 h，觀察菌落形態差異并計數。

1.3.2?腸道腸桿菌細菌的分離純化、計數和初步鑒定?統計稀釋平板上細菌克隆數目，然后根據平板上細菌克隆的形態、顏色和大小，挑取圓形邊緣整齊、表面光滑、半透明的菌落進行單克隆劃線。從劃線平板上選取單克隆再次劃線，經過兩次純化，保證得到單一純化的菌株。為了確認分離的細菌菌株是否為腸桿菌，純化菌株同時被接種于伊紅美藍乳糖培養基上。培養后，分離的細菌菌株在伊紅美藍乳糖培養基上呈現深紫色菌落被初步認定為腸桿菌菌株，分離純化和初步確認的腸桿菌菌株按20%比例加入甘油，置-20℃冰箱保種。為了進一步驗證，從保存菌種中隨機挑取5～8株接種到LB液體培養基，37℃、220 r·min-1培養24 h，用于基因組DNA的提取和分子鑒定。

1.3.3?腸道可培養腸桿菌16S rRNA的PCR擴增、鑒定和系統進化樹構建?取動物腸道細菌的代表性菌株菌液1.5 mL，8000 r·min-1離心5 min，去上清，采取改良的酚氯仿法抽提腸道細菌基因組[8]。以提取的細菌基因組為模板，采用通用引物27f/1492r進行PCR擴增細菌16S rRNA[9]。PCR反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性 45 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環25次，72℃延伸10 min。擴增產物純化后送至上海生工雙向測序，獲得的序列遞交至RDP數據庫確定其分類地位。同時在NCBI數據庫中對各個序列進行BLAST，篩選同源序列。將分離純化的可培養細菌的16S rRNA序列與下載的同源序列通過SeaView的ClustalX程序進行完全比對。編輯后用SeaView的tree程序構建PhyML系統進化樹[10]。

1.3.4?菌落影印和抗生素抗性篩選[11] 取出保存的甘油菌液置于冰上，待完全融化后分別移取50 μL到對應的96孔板中，標記備用。將預先配制的固體LB培養基滅菌后冷卻至60℃，按表1中所需工作濃度分別加入相應的抗生素，混勻后倒入方形平板，靜置，待培養基完全凝固后，用帶有96針的影印工具“印章”對準96孔板，輕蘸使其均勻帶有相應的菌液;再把此印章在含有不同抗生素的培養基平板上輕輕印一下。印好10個含有不同抗生素的培養基平板后，將平板放在37℃的培養箱中培養12～16 h，觀察培養基平板上菌落生長情況并計數。統計對每一種抗生素具有抗藥性的微生物的數目，計算抗性微生物比例。計算公式：抗性微生物比例=具有抗性菌株數/總測試菌株×100%。

2?結果與分析

2.1?寵物犬腸道可培養細菌的分離鑒定

從寵物犬糞便稀釋平板上一共挑取200個左右同一類別細菌單菌落，細菌菌落形態、大小和顏色，以及鏡檢比較一致，染色結果均為革蘭氏陰性。通過伊紅美藍乳糖培養基的進一步篩選，初步確認菌株為腸桿菌菌株。挑選8株寵物犬腸道來源的腸桿菌菌株，提取基因組后，以通用引物27f/1492r擴增細菌16S rRNA。測序后最終得到5條全長16S rRNA序列，序列經過對比并遞交RDP進行分子鑒定，結果表明挑選的5株腸道細菌16S rRNA序列完全一致，確定挑取的5株來源于寵物犬腸道的革蘭氏陰性細菌均為腸桿菌科埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）。收集得到的5條全長16S rRNA序列dog_4、dog_6、dog_7、dog_L4、dog_L5，用于下一步的系統進化分析。

2.2?寵物犬腸道可培養細菌16S rRNA系統發育樹的構建

將得到的寵物腸道中的5株腸桿菌菌株16S rRNA序列分別在NCBI nt數據庫進行比對，選取并下載同源序列以及腸桿菌科主要屬典型菌株的16S rRNA序列，利用SeaView的ClustalX程序將目的序列與已知的腸桿菌科

16S rRNA序列進行比對，編輯后用SeaView的tree程序構建PhyML系統進化樹（圖1）。細菌16S rRNA的系統發育分析表明，所分離的寵物犬腸道中可培養細菌聚于腸桿菌科的Ecoli?Shigella分支，由此可以看出這些寵物犬來源的腸道細菌菌株序列高度同源，彼此間的親緣關系很近。

2.3?寵物犬腸道可培養細菌抗生素抗性或敏感性分析

2.3.1?寵物犬腸道可培養細菌的耐藥性及抗性細菌在腸道微生物中的比例?在確定分離菌株為大腸桿菌菌株的基礎上，對其中的192株分離純化的寵物犬腸道大腸桿菌菌株抗生素耐藥性進行分析，結果表明寵物犬腸道大腸桿菌對氨芐青霉素（AMP）的抗性最為普遍，耐藥性比例達到了90%。其次對萘啶酮酸（NaA）、鹽酸四環素（TC）、鹽酸克林霉素（DA）、磺胺嘧啶（SD）耐藥性比例也均在80%以上。在耐藥性比例較高的5種抗生素中，氨芐青霉素、四環素和磺胺類藥物都屬于應用范圍廣，使用時間比較長的臨床常備抗生素，較高的抗性微生物比例說明該類抗生素或者抗性微生物在家養犬或者環境中廣泛存在。寵物犬腸道微生物對其余幾種抗生素的抗性比例相對較低，除紅霉素（Ery）抗性比例達到42.5%外，其余均小于20%，其中對硫酸鏈霉素的抗性比例僅為5.8%，說明硫酸鏈霉素對所分離出的大腸桿菌菌株具有很好的抑制或殺害作用。

2.3.2?寵物犬腸道可培養微生物中的多重抗性細菌?根據鏡檢和分子鑒定結果，從寵物犬糞便分離培養得到的菌株均為大腸桿菌。測試的192株細菌中97%以上菌株具有至少1種以上的抗生素抗性，其中有60.3%的細菌具有5種或6種抗生素抗性，比例最多，說明被檢測細菌具有較廣泛的抗生素抗性，并且這些抗性集中在幾種抗生素上，表明這些耐藥性在寵物犬腸道微生物中已經固化，形成了穩定的菌群結構和遺傳結構。只有極少數不到3%的菌株沒有表現出對任何抗生素具有抗性，說明了寵物犬腸道細菌普遍具有抗生素抗性。被檢測的細菌中有6.4%對9種抗生素具有抗性，這表明在動物腸道內已有部分細菌進化出了非常廣泛的抗性，這與臨床中廣泛存在超級細菌的結果是一致的。

2.4?寵物犬腸道可培養細菌在環境中的分布及其抗性的潛在傳播途徑

通過收集和統計NCBI數據庫中與鑒定的腸道可培養細菌具有高度序列同源性的細菌16S rRNA序列（序列同源性>99%），并對這些序列的來源與分布信息進行整理分析，發現在NCBI數據庫中已經報道許多與分離的可培養細菌16S rRNA序列同源性大于99%的細菌。這些腸桿類細菌在環境中有非常廣泛的分布。與被測的大腸桿菌16S rRNA有高度相似的細菌菌株在歐洲、亞洲和美洲如（美國、中國、英國、捷克、巴基斯坦等眾多國家）都有報道，在豬、鼠、牛、雞、麝香鹿以及被污染的河水等均大量存在，從陸地到海洋都有分布，可以說明這些細菌具有廣泛的地區分布;這些有高度相似的細菌菌株主要分布在土壤、水、根中，然而這些細菌在動物腸道內也能被檢測出，說明了環境微生物與動物體內微生物之間的交叉感染。根據這些不同環境微生物之間的相互關聯，形成了細菌在不同環境之間可能存在的關系鏈或關系網。

有研究表明，病原菌主要是在基因水平進行轉移，這些病原菌會從含有抗性基因的同一或親緣關系較近的細菌類群中獲得抗性基因。其次，Sommer等[12]研究表明腸道可培養細菌（通常為兼性厭氧細菌或機會致病菌）以及環境中的同類細菌與病原菌含有的抗性基因具有高度的同源性，說明動物腸道中的可培養細菌可能會導致病原菌獲得抗性基因。大腸桿菌能夠適應各種環境，具有非常廣泛的分布，而大量的人口流動及動物遷徙為細菌快速廣泛地傳播提供了有利條件。由此看來，動物腸桿菌類細菌很可能是人體病原菌獲得抗性基因以及抗性基因傳播的重要載體。因此，同一環境中不同來源的腸桿菌類互相傳播，也可能是耐藥性基因在不同微生物和人類病原菌之間相互傳播的潛在途徑[13]。

3?討論與結論

寵物是一個潛在的細菌貯存庫，其糞便、口腔、對人的生理性傷害（包括咬傷、抓傷）都是細菌傳播的途徑。人與寵物的親密接觸和共同的生活環境是細菌傳播的條件。2006年美國有一病例報道，寵物主人被有抗菌藥治療史的犬咬后，發現感染了來自犬的多重耐藥大腸桿菌和腸球[14]。目前國內對食品動物抗菌藥的使用有嚴格規定，但是對于寵物醫療方面，始終很少人去關注。實際上隨著國內寵物行業的蓬勃發展，抗菌藥的使用量非常大，加上小動物臨床從業人員良莠不齊，或受經濟利益驅使，無指征用藥、濫用和不合理使用抗菌藥現象很嚴重，由此導致的耐藥問題可能比較突出[15]。加上寵物活動范圍相對較廣，不同環境之間微生物抗性基因之間的相互傳遞，導致耐藥譜越來越廣。

本研究通過對寵物犬的腸道可培養細菌耐藥性進行調查研究及統計分析，發現寵物犬腸道細菌對不同家族抗生素抗性具有明顯差異。在測試的192株寵物犬腸道大腸桿菌中，超過80%菌株對氨芐青霉素鈉、萘啶酮酸、鹽酸四環素、鹽酸克林霉素、磺胺嘧啶具有明顯抗性;相反，只有不到20%測試菌株對氯霉素、硫酸鏈霉素、環丙沙星鹽酸鹽和頭孢氨芐具有抗性。根據報道，國內獸醫臨床上最常用的抗菌藥物有青霉素類、頭孢菌素類、大環內酯類、氨基糖苷類、磺胺類、夫西地酸、四環素類、氯霉素類、林可胺類和氟喹諾酮類等。而其中氨芐青霉素、磺胺類藥物、四環素等是最早應用在獸醫臨床并且使用時間也是最長[16]。本研究對寵物犬腸道大腸桿菌耐藥性的調查也反映了這一趨勢，盡管有一定的差別，總的來說，測試的大腸桿菌對氨芐西林、磺胺類藥物、氯霉素、鏈霉素和四環素等較早使用藥物的耐藥率較高，對頭孢菌素類藥物相對較敏感。這一結論與先前國外類似的工作結果是一致的[16]。

在多重耐藥菌方面，寵物動物中的細菌所攜帶的抗生素數目不盡相同，寵物犬腸道細菌中97%以上菌株具有至少一種以上的抗生素抗性。在寵物腸道微生物中有超過一半的測試細菌攜帶4～6種耐藥性。寵物類腸道中耐藥性微生物的比例以及這些微生物對不同抗生素抗性的差異可能與抗生素的使用密切相關。寵物腸道中出現多株多重耐藥細菌的原因一方面可能是相關抗生素的廣泛使用甚至濫用有關。Rantala等[16]對芬蘭有過抗菌藥治療史的慢性皮膚病患犬與無用藥史犬身上的葡萄球菌、腸桿菌和腸球菌耐藥率進行比較，發現用藥犬的葡萄球菌對磺胺（TMP）耐藥率（57%）明顯高于未用藥犬的耐藥率（25%），且多重耐藥性更普遍（29%比9%）;另一方面可能是因為抗生素抗性基因之間的連鎖現象導致的共篩選。也就是說當多重耐藥性共存于同一載體，比如轉座子或者抗性質粒，當其中一種耐藥性被環境中存在的抗生素篩選時，其他的耐藥性也同時被篩選[17]。Brenciani等[18]發現在125株攜帶大環內脂類抗生素抗性基因erm（B）的釀膿葡萄球菌中有117株也同時攜帶四環素抗性基因tet（M），并證明基因erm（B）和tet（M）是連鎖的。Levy等[19]發現用添加亞治療劑量土霉素飼料喂養的雞排泄物中，大腸桿菌具有土霉素抗性，還具有鏈霉素、磺胺和氨芐西林抗性。

作為人的親密伙伴，寵物通常被賦予了比經濟價值更大的社會價值，因而在其感染性疾病的治療中經常會使用更高級和更昂貴的抗生素，甚至是最新一代的人用抗生素藥物。而在臨床上，由于抗生素的不正確使用、濫用和誤用，是導致這些動物腸道微生物耐藥性產生的主要原因[20]。而寵物和人之間的密切接觸使得細菌更加容易通過寵物傳播給人或者人傳播給動物從而傳播疾病。例如寵物犬和寵物貓攜帶的人獸共患病病原菌可通過糞-口途徑、皮膚外傷（犬咬傷或貓抓傷）或媒介昆蟲傳播給人，這種流行多為散發且難于統計。研究表明MRSA更多的是通過人傳播給寵物，寵物并不感染發病而是作為貯存宿主，從醫務人員家里養的寵物中更容易分離到MRSA[21]。寵物與人之間不僅僅存在細菌的相互傳播，也存在基因的傳遞，寵物的耐藥性基因可能通過細菌轉移到人體從而增加人患病的風險性。分離于尿路感染病犬的耐萬古霉素糞腸球菌攜帶與人VRE 相同的轉座子Tn1546，該轉移元件編碼萬古霉素耐藥基因vanA，證明了人和犬分離株可能存在著移動元件的交換[22]。另一個研究較深的例子是對寵物病原菌葡萄球菌耐藥機制的研究。研究人員發現部分分離株的四環素類耐藥基因tet K、大環內酯類及林可酰胺類耐藥基因ermC和氯霉素耐藥基因catpC221是由質粒介導，這些質粒與人源葡萄球菌質粒具有很高的同源性[20，23]。綜合以上分析結果表明，由于抗生素被作為醫療用藥和飼料添加劑的長期使用，動物體內細菌對抗生素產生耐藥性，并根據使用的抗生素種類和劑量的不同，耐藥也有所不同。而這些耐藥微生物及其攜帶的耐藥性基因將通過食物鏈或動物活動，例如直接接觸或者糞便轉移到人類體在動物與人體之間相互傳播，從而對人體健康造成影響。

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（責任編輯：林玲娜）