魚腥草飲片標準湯劑的制備及質量控制方法研究

邱連建， 朱衛星， 陳會朋

[1.北京中醫藥大學深圳醫院（龍崗），廣東深圳 518000；2.清遠市中醫院，廣東清遠 511500]

魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鮮全草或干燥地上部分。味辛，性微寒，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋的功效[1]。臨床上常與其他中藥配伍用于治療肺炎、支氣管炎、流行性腮腺炎、咽炎、風熱型急性卡他性結膜炎、病毒性腸炎等疾病[2-4]，具有較高的臨床應用價值。其化學成分有生物堿、黃酮類、有機酸、揮發油類等[5]。2015年版《中華人民共和國藥典》[1]（以下簡稱《中國藥典》）以甲基正壬酮為對照，利用薄層色譜對魚腥草進行定性鑒別，并規定了魚腥草浸出物限度，但缺乏相應的有效成分含量控制指標，因此，魚腥草的質量標準有待于進一步的提高與完善。

標準湯劑是以中醫理論為指導，按照傳統煎藥方式進行煎煮得到的單味中藥飲片水煎劑，用于制定中藥配方顆粒質量標準，以保證中藥配方顆粒與標準湯劑的一致性[6]。因此，本研究從標準湯劑角度，以市場上收集的24批魚腥草飲片為原料，按照全草類中藥飲片標準湯劑制備工藝，進行魚腥草飲片標準湯劑研究，建立了魚腥草標準湯劑的特征圖譜，以及有效成分槲皮苷的含量測定，以期為魚腥草配方顆粒質量評價提供參考，現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1儀器與試劑Waters高效液相色譜儀，Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀，CHEMSTATION C.01.04化學工作站，Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm ×250 mm，5μm）色譜柱，Phenonmenex Luna-C18色譜柱；ME204E萬分之一天平、XP26百萬分之一天平（梅特勒—托利多公司）；KQ-500DE數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS28電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。甲醇、乙醇（天津富宇精細化工有限公司），為分析純；液相用甲醇、乙腈（德國默克股份有限公司），為色譜純；磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司），為色譜純；超純水（取自實驗室Milli-Q超純水系統，德國默克股份有限公司）。

1.2試藥綠原酸（含量96.2%，批號：110753-201415）、金絲桃苷（含量93.3%，批號：111521-201205）、槲皮苷（含量90.6%，批號：111538-201606）均由中國食品藥品檢定研究院提供。隱綠原酸（含量≥98%，批號：15121701）、新綠原酸（含量≥98%，批號：151217）均來自成都普菲德生物技術有限公司。

1.3樣品分別收集了3個產地共24批魚腥草樣品，樣品經廣東一方制藥有限公司質檢中心鑒定為魚腥草。按照2015年版《中國藥典》進行含量測定。樣品信息及含量測定結果見表1。

2 方法與結果

2.1魚腥草飲片標準湯劑的制備取魚腥草飲片100 g，加水煎煮2次，第1煎加水14倍量，浸泡30 min，保沸20 min，350目篩網濾過。第2煎加水12倍量，保沸15 min，350目篩網濾過。合并2次濾液，減壓濃縮至250 mL流浸膏，真空冷凍，即得。

表1 魚腥草藥材與飲片信息表Table 1 Data of Herba Houttuyniae materials and crude slices

2.2出膏率測定量取煎煮液總體積V（室溫），攪拌均勻后精密吸取25 mL提取液至干燥恒質量的蒸發皿中。水浴蒸干后，于105℃干燥3 h，干燥器中冷卻后，迅速精密稱定質量m1。藥材質量為m2。測出膏率＝（m1×V）/（0.025×m2）×100%。計算平均出膏率，結果見表2。結果表明，24批魚腥草標準湯劑平均出膏率為17.40%，標準偏差（SD）為1.41%。《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》允許出膏率為均值的70%～130%或均值加減3倍的SD，因此，魚腥草標準湯劑出膏率范圍為12.18%～22.62%或13.17%～21.63%。

2.3魚腥草飲片標準湯劑含量測定

2.3.1 色譜條件色譜柱：Kromasil-C18（4.6 mm×25 cm，5μm）；流動相：乙腈—0.1%磷酸水（23∶77）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

表2 24批魚腥草飲片標準湯劑出膏率的測定Table 2 The extraction rate of twenty-four batches of Herba Houttuyniae crude slices standard decoction（p/%）

2.3.2 對照品溶液制備 取槲皮苷對照品適量，精密稱定，用體積分數50%甲醇制成質量濃度為30μg/mL的對照品儲備液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取魚腥草飲片標準湯劑凍干粉約0.1 g，精密稱定，精密加入50 mL體積分數50%甲醇溶液溶解并超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，補足失質量，搖勻，濾過，即得。

2.3.4 線性關系考察 以“2.3.2”項下的槲皮苷對照品儲備液為基礎，依次配制濃度為15.0、7.5、3.7、1.8、0.9μg/mL的溶液。分別精密吸取10μL，按“2.3.1”項下方法進樣記錄峰面積。以槲皮苷對照品濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程：y=27.88x-3.520，R2=1。結果表明在0.973～31.137 μg/mL范圍內對照品濃度與峰面積線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取槲皮苷對照品（31.137μg/mL），按照“2.3.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄色譜峰保留時間和峰面積值，計算槲皮苷的峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.09%。結果表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗 取同一批魚腥草飲片標準湯劑（S1），精密稱定，按“2.3.3”項下平行制備供試品溶液6份。精密吸取10μL，按“2.3.1”項下色譜條件測定。結果顯示魚腥草飲片標準湯劑中槲皮苷平均含量為6.16 mg/g，RSD為1.86%，表明該分析方法的重復性良好。

2.3.7 穩定性試驗 取魚腥草飲片標準湯劑供試品溶液（S1），按照“2.3.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、30 h進樣，測定供試品溶液中槲皮苷的峰面積，計算峰面積RSD為0.41%。結果表明，供試品溶液在30 h內穩定。

2.3.8 加樣回收試驗 取已知含量的魚腥草飲片標準湯劑凍干粉（S1）約0.05 g，精密稱定，根據標準湯劑中槲皮苷的含量按1∶1的比例添加槲皮苷對照品，按“2.3.3”項下供試品溶液制備方法制成加樣回收供試品溶液6份，按“2.3.1”項下色譜條件進行試驗。計算供試品溶液中槲皮苷的平均加樣回收率為101.48%，RSD為0.87%，結果表明該方法的準確度良好。

2.3.9 魚腥草飲片標準湯劑含量測定及轉移率 取所制備的24批魚腥草飲片標準湯劑，每批平行2份。按“2.3.3”項下制備供試品溶液，每份精密吸取10μL按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算槲皮苷含量，根據公式計算：轉移率（%）=結果表明，24批魚腥草標準湯劑槲皮苷平均含量為6.94 mg/g，槲皮苷含量范圍為4.86～9.02 mg/g，槲皮苷轉移率均值為46.28%，槲皮苷轉移率范圍為32.40%～60.16%。

表3 24批魚腥草飲片標準湯劑槲皮苷含量及轉移率Table 3 The content and transfer rate of quercetin in twenty-four batches of Herba Houttuyniae crude slices standard decoction

2.4指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件YMC-Triart C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；進樣量：10μL；檢測波長：0～30 min為326 nm，30～80 min為254 nm；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸水為流動相B，按表4規定的梯度進行洗脫，流速為1.0 mL/min。

表4 魚腥草飲片標準湯劑特征圖譜梯度洗脫程序Table 4 The gradient elution procedure for characteristic spectrum of Herba Houttuyniae crude slices standard decoction

2.4.2 供試品溶液制備 取魚腥草飲片標準湯劑約0.1 g，精密稱定，精密加入25 mL的體積分數50%甲醇溶解，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用體積分數50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4.3 精密度試驗 取同一批魚腥草飲片標準湯劑供試品溶液（S18），按照“2.4.1”項下色譜條件重復進樣6次，進樣體積10μL。以2號峰綠原酸為參照峰，計算相對保留時間。結果顯示各峰的相對保留時間RSD＜0.29%，表明該特征圖譜的精密度較好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批魚腥草飲片標準湯劑（S18）約0.1 g，精密稱定，平行6份，按“2.4.2”項下制備供試品溶液。按“2.4.1”項下色譜條件，進樣10μL，以2號峰綠原酸為參照，計算相對保留時間。結果顯示各峰的相對保留時間RSD＜0.15%，表明該特征圖譜的重復性良好。

2.4.5 穩定性試驗 取魚腥草飲片標準湯劑（S18）項下供試品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，進樣10μL，以2號峰綠原酸為參照，計算各峰相對保留時間。結果顯示24 h內各色譜峰相對保留時間RSD＜2.0%，表明該供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.6 樣品檢測與分析 分別取24批魚腥草飲片標準湯劑，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分別測定及記錄高效液相色譜（HPLC）指紋圖，見圖1。使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件對24批魚腥草標準湯劑特征圖譜進行共有峰標識，經分析找到了6個共有峰，其中經對照品指認，指認了其中5個峰，分別是峰1：新綠原酸；峰2：綠原酸；峰3：隱綠原酸；峰5：金絲桃苷；峰6：槲皮苷。見圖2。

圖1 24批魚腥草飲片標準湯劑的HPLC指紋圖譜Figure 1 HPLC fingerprints of twenty-four batches of Herba Houttuyniae crude slices standard decoction

圖2 魚腥草飲片標準湯劑特征圖譜Figure 2 The characteristic spectrum of Herba Houttuyniae crude slices standard decoction

3 討論

本研究考察并建立了魚腥草飲片標準湯劑的質量控制方法。

3.1供試品處理考察對魚腥草飲片標準湯劑前處理重點考察了提取溶劑及提取時間。溶劑種類中考察了水、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、乙醇，結果發現特征圖譜樣品中6個共有特征峰“總峰面積/稱樣量”比值以50%甲醇作為溶劑時最大，且各峰的分離效果最優；含量測定樣品中以50%甲醇作為溶劑時提取效率最高。因此均選擇50%的甲醇作為提取溶劑。超聲提取不同時間（15、30、45、60 min）的特征圖譜色譜峰數目、分離度及特征圖譜6個特征峰“總峰面積/稱樣量”無明顯差異，超聲30 min已經基本提取完全，且超聲提取30 min槲皮苷含量最高，最終均確定超聲提取時間為30 min。

3.2魚腥草飲片標準湯劑質量控制本研究主要從3個方面對魚腥草標準湯劑的質量控制進行把關：①藥材的選擇涵蓋了魚腥草的道地產區和主產區，經檢測均符合2015年版《中國藥典（一部）》的相關項下要求，所選樣品從產地、質量水平等方面均具有代表性。②標準湯劑參照國家藥典委員會制定的《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求（征求意見稿）》和國家中醫藥管理局制定的《醫療機構中藥煎藥室管理規范》進行制備，與傳統湯藥在藥效和成分上保持一致。③中藥是由多成分、多靶點協同發揮作用的，采用指標成分結合指紋圖譜方法控制魚腥草標準湯劑的質量，克服了傳統采用1～2種成分含量控制中藥質量的不合理性。

2015年版《中國藥典》以甲基正壬酮為對照，利用薄層色譜對魚腥草進行了定性鑒別，但缺乏相應的有效成分含量控制指標，揮發油的量也未進行控制，因此，魚腥草的質量標準有待于進一步的提高與完善。考慮到魚腥草中揮發油的含量極低，以及以干魚腥草作為原料，在制備標準湯劑過程中造成揮發油的損失，采用揮發油中的有效成分作為含量控制指標存在一定的困難。魚腥草中含有多種黃酮類成分，包括槲皮素、槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷等，具有殺菌、祛痰、止咳、抗炎、抗過敏等作用，通過對魚腥草特征圖譜研究，發現槲皮苷峰型最高，且分離效果良好。已有文獻報道，槲皮苷具有抗病毒、抗炎、利尿等作用[7-8]，是魚腥草的主要有效成分之一，采用槲皮苷作為魚腥草的含量控制指標也有一定的文獻基礎[9-14]。因此，本研究采用HPLC測定魚腥草中槲皮苷的含量，作為魚腥草的含量控制指標。

中藥飲片標準湯劑失去了原有飲片的形態學特征，單純的指標成分的定性和定量分析難以反映其質量的優劣，故中藥飲片標準湯劑質量控制要重視以指紋圖譜為主的整體質量控制。本實驗選用不同產地的24批魚腥草制備魚腥草飲片標準湯劑，考察槲皮苷含量，并建立其HPLC指紋圖譜，從指標成分定量和整體定性的角度對魚腥草進行全面質量控制。本方法準確、可行、重復性良好，可為所有源于魚腥草湯劑制劑質量標準的制定提供參考。