柴胡皂苷A對糖尿病大鼠腎結構和功能的保護作用及機制研究

張曉利， 胡威利， 吳銀， 孫昆， 周一龍， 路芳

（1.新鄉醫學院第三附屬醫院腎病風濕科，河南新鄉 453000；2.新鄉醫學院第三附屬醫院血液凈化室，河南新鄉 453000）

長期處于高糖狀態下的腎臟損害是糖尿病最常見的微血管并發癥，其腎功能往往損傷嚴重[1]，約30%的1型糖尿病將發展成終末期腎病[2]。因此，防治糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者的腎臟損害具有重要的研究意義。柴胡是常用傳統中藥材之一，味苦，性微寒，入肝膽經，具有和解少陽、疏肝解郁、升陽的功效。其主要成分柴胡皂苷A（saikosaponin A）是一種具有多種藥理活性的三萜皂苷，具有保肝、護腎、抗炎、抗病毒、抗癲癇、抗抑郁、抗癌和抗氧化等作用[3-10]。既往研究發現，氧化應激、高血糖、糖基化終產物的產生和多種信號通路在糖尿病腎病的發病機制中起著至關重要的作用[11-13]。基于此，本研究建立糖尿病大鼠和高糖誘導的腎小管上皮細胞模型，探討柴胡皂苷A對糖尿病模型大鼠的療效及保護其腎結構和功能的機制，以期為臨床應用柴胡皂苷A干預糖尿病腎病提供參考，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物50只SPF級SD雄性大鼠，體質量為180～220 g，購自北京維通利華公司，動物質量合格證號：SCXK（京）2015-0001。于河南省新鄉市精神生物病學重點實驗室SPF級別動物飼養房飼養，實驗動物使用許可證號：SYXK（豫）2014-0000。

1.2細胞大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E購自中國科學院。用含體積分數為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養基，于37℃、體積分數5%CO2的恒溫培養箱中培養。

1.3藥物與試劑柴胡皂苷A（分子式：C42H68O13；分子量：780.98；純度：HPLC998%；批號：SS8020）購自北京索萊寶公司，經二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成母液，-20℃避光保存。二甲雙胍（metformin），購自中國食品藥品檢定研究院。DMSO、蘇木素—伊紅（HE）染色試劑盒，購自北京索萊寶公司；胎牛血清、杜爾貝科改良培養基（Dulbecco’smodified Eagle’smedium，DMEM）、鏈脲佐菌素干粉，購自美國Sigma公司；TRIzol試劑盒、反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒，購自美國ThermoFisher公司；血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、尿蛋白（UP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；兔源異檸檬酸脫氫酶2（IDH2）、錳超氧化物歧化酶（MnSOD）和沉默信息調節因子3（SIRT3）、GAPDH單克隆抗體及二抗，購自美國Abcam公司。

1.4主要儀器雅培安妥血糖儀及試紙（美國雅培公司）；PCR儀、電泳儀及半干轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；Gel View 6000化學發光凝膠成像系統（廣州云星儀器有限公司）；酶標儀（美國Thermo公司）；低溫離心機（美國IEC公司）；普通光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.5動物實驗

1.5.1 動物分組、造模及給藥 大鼠適應性飼養7 d后，隨機分為6組，即正常組、模型組、柴胡皂苷A低劑量組（5 mg/kg）、柴胡皂苷A中劑量組（10 mg/kg）、柴胡皂苷A高劑量組（20 mg/kg）[14]和二甲雙胍組（350 mg/kg）[15]，每組6只。采用高脂喂食結合化學誘導法建立糖尿病大鼠模型[16-17]，方法：除正常組之外，其他各組大鼠分別喂食高脂飲食4周后，一次性腹腔注射用pH 4.5枸櫞酸緩沖液溶解配制成的鏈脲佐菌素（30 mg/kg）0.1 mL，構建糖尿病大鼠模型；而正常組喂食普通飼料4周后，一次性腹腔注射0.1 mL枸櫞酸緩沖液。72 h后，大鼠尾靜脈空腹取血測定血糖值，血糖值若超過11.1 mmol/L則判斷造模成功，即可用于后續實驗。造模成功后，各給藥組分別對應給予藥物灌胃，正常組和模型組給予等容量生理鹽水灌胃，每天給藥1次，連續28 d。

1.5.2 腎功能指標24 hUP、SCr、BUN檢測 按照24 hUP、SCr、BUN測試盒說明方法，應用可見分光光度計在595 nm波長處測24 hUP吸光度值，在546 nm波長處測SCr吸光度值，在640 nm波長處測BUN吸光度值。

1.5.3 腎臟肥大指數 稱取大鼠雙側腎質量及體質量計算腎臟肥大指數，腎臟肥大指數=雙腎質量（m/mg）/體質量（m/g）。

1.5.4 HE染色法觀察大鼠腎臟病理損傷情況 大鼠腎組織經體積分數10%福爾馬林溶液充分固定，酒精梯度脫水，常規石蠟包埋后，制作成約4μm厚度的病理切片，再根據HE染色試劑盒說明書進行HE染色。在光學顯微鏡下觀察各組大鼠腎臟組織的病理變化。

1.5.5 酶聯免疫吸附分析（ELISA）檢測腎臟組織氧化應激因子SOD、GSH-Px活性及MDA含量 收取大鼠腎臟組織勻漿液上清，根據SOD、GSH-Px、MDA ELISA試劑盒說明書，應用酶標儀于450 nm波長處測定SOD吸光度值，采用可見分光光度計于420 nm波長處測GSH吸光度值，于532 nm波長處測定MDA吸光度值。

1.5.6 逆轉錄—聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA表達 用TRIzol試劑提取腎臟組織總RNA，并使用反轉錄試劑盒合成cDNA。使用SYBR Green PCRMaster試劑盒進行PCR。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環。72℃延長10 min。反應結束后加做熔解曲線，以區分擴增產物及引物二聚體。根據擴增曲線和熔解曲線結果進行PCR定量標準曲線的制作。引物序列：IDH2（forward：5’-AATTAGCC CCGTCTG-3’； reverse：5’-GGGGAGAGAGAGA GACATTGAA-3’），擴增片段長度為98 bp。MnSOD（forward：5’-AAGGAGCAGGTCTTAGCAGA-3’；reverse：5’-CAAATGGGCTAGTAGTCAGGTC-3’），擴增片段長度為285 bp。SIRT3（forward：5’-GCT GACGACTTCGACGACG-3’；reverse：5’-TCGGT CAACAGGAGGTTGTCT-3’），擴增片段長度為130 bp。

1.5.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3表達 用含蛋白抑制劑的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解大鼠腎臟組織提取總蛋白，4℃離心收集上清，用二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量。取等量蛋白進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉移蛋白質到聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉蛋白質2 h后，分別加入IDH2、MnSOD、SIRT3、GAPDH等一抗（稀釋度為1∶800）4℃孵育過夜。棄去一抗，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。以化學發光法于暗室曝光顯影。應用Image J軟件統計灰度值，結果以目的蛋白與GAPDH內參蛋白的灰度值比值表示。

1.6細胞實驗

1.6.1 細胞模型 待NRK-52E細胞生長至融合狀態后，將細胞分為正常組、高糖組、柴胡皂苷A 5μmol/L組、柴胡皂苷A 10μmol/L組、柴胡皂苷A 20μmol/L組[18]。其中：正常組培養基含5.6 mmol/L葡萄糖，高糖組、柴胡皂苷A 5μmol/L組、柴胡皂苷A 10μmol/L組、柴胡皂苷A 20μmol/L組培養基含30 mmol/L葡萄糖[19]，分別刺激24 h。

1.6.2 ELISA法檢測細胞MDA、SOD、GSH-Px含量 收取各組NRK-52E細胞培養液上清，具體檢測步驟同“1.5.5”項。

1.6.3 RT-PCR法檢測細胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA表達 用TRIzol試劑提取細胞總RNA，后續具體檢測步驟同“1.5.6”項。

1.6.4 Western Blot法檢測細胞IDH2、MnSOD、SIRT3蛋白表達 用含蛋白抑制劑的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解NRK-52E細胞提取總蛋白，后續具體操作步驟同“1.5.7”項。

1.7統計方法采用SPSS18.0統計軟件對所有實驗數據進行分析，數據結果以均數±標準差（-x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析進行檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和腎臟肥大指數比較圖1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和腎臟肥大指數均顯著增加（P＜0.01）。表明該糖尿病模型大鼠存在腎功能損害。與模型組比較，柴胡皂苷A中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和腎臟肥大指數均下降（P＜0.05或P＜0.01），且3個治療組大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和腎臟肥大指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明柴胡皂苷A可有效減輕糖尿病大鼠腎功能損傷，并具有劑量依賴性。

圖1 各組糖尿病大鼠24 hUP、SCr、BUN水平和腎臟肥大指數比較（±s，N=6只）Figure 1 Comparison of the levels of 24 hUP，SCr and BUN，as well as renal mass index in various groups（±s，N=6）

2.2各組大鼠腎臟病理改變比較圖2結果顯示：正常組大鼠腎臟組織腎小球體積正常，未見系膜細胞增生，腎小管間質區結構清晰，細胞排列緊密、胞漿豐富；模型組大鼠腎臟組織腎小球體積明顯增大，系膜基質增多，腎小管腫脹、空泡樣變性，伴有炎性浸潤等；各給藥組大鼠腎組織病變均較模型組減輕，其中，柴胡皂苷A中、高劑量組和二甲雙胍組僅見腎小管細胞輕度腫脹、空泡樣變性。

圖2 各組糖尿病大鼠腎臟病理改變比較（HE染色，×200；N=6只）Figure 2 Comparison of the rat renal pathological changes in various groups（by HEstaining method，×200；N=6）

2.3各組大鼠腎臟組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較圖3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，柴胡皂苷A中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低（P＜0.05或P＜0.01），且3個治療組大鼠腎臟組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明柴胡皂苷A具有有效促進糖尿病大鼠腎臟組織抗氧化酶活性、減少脂質過氧化物生成進而抑制氧化應激反應的作用，且呈劑量依賴性。

圖3 各組糖尿病大鼠腎臟組織SOD、GSH-Px活性，MDA含量比較（±s，N=6只）Figure 3 Comparison of the activity of SOD and GSH-Px，and MDA content in rat renal tissue of various groups（±s，N=6）

圖4 各組糖尿病大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達比較（±s，N=6只）Figure 4 Comparison of the mRNA and protein expression levels of IDH2，MnSOD and SIRT3 in rat renal tissue of various groups（±s，N=6）

2.4各組大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達比較圖4結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達水平均降低（P＜0.01）；與模型組比較，柴胡皂苷A中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達水平均升高（P＜0.05或P＜0.01），且3個治療組大鼠腎臟組織IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。表明柴胡皂苷A具有增強糖尿病大鼠腎臟組織抗氧化能力的作用，且呈劑量依賴性。

2.5各組大鼠NRK-52E細胞SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較圖5結果顯示：與正常組比較，模型組NRK-52E細胞SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，柴胡皂苷A 10、20μmol/L組NRK-52E細胞中SOD、GSH-Px活性增加，MDA含量減少（P＜0.05或P＜0.01）。表明柴胡皂苷A具有有效促進高糖誘導的腎小管上皮細胞抗氧化酶活性、減少脂質過氧化物生成進而減輕氧化應激損傷的作用，且呈劑量依賴性。

2.6各組大鼠NRK-52E細胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達比較圖6結果顯示：與正常組比較，模型組NRK-52E細胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達水平均降低（P＜0.01）；與模型組比較，柴胡皂苷A 10、20 μmol/L組NRK-52E細胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達水平均降低（P＜0.05或P＜0.01）。表明柴胡皂苷A具有增強高糖誘導的腎小管上皮細胞抗氧化能力的作用，且呈劑量依賴性。

3 討論

糖尿病腎病是一種嚴重的糖尿病微血管并發癥，主要病理變化表現為腎小球濾過率增加，伴隨腎小球肥大和硬化、腎小管萎縮和間質纖維化及系膜增生等病理改變，臨床上以持續的蛋白尿和腎功能進行性下降為主要表現[20]。早期預防和治療十分必要。

圖5 各組NRK-52E細胞SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較（±s）Figure 5 Comparison of the activity of SOD and GSH-Px，and MDA content in NRK-52E cells of various groups（±s）

圖6 各組NRK-52E細胞IDH2、MnSOD、SIRT3 mRNA和蛋白表達比較（±s，n=3）Figure 6 Comparison of the mRNA and protein expression levels of IDH2，MnSOD and SIRT3 in NRK-52E cells of various groups（±s，n=3）

為觀察糖尿病大鼠腎結構和功能變化，本研究采用高脂喂食結合化學誘導法構建了糖尿病大鼠模型。結果顯示：模型組大鼠腎臟功能指標24 hUP、SCr、BUN水平升高，腎臟肥大指數增加，腎臟組織可見腎小球體積明顯增大，系膜基質增多，腎小管腫脹、空泡樣變性，伴有炎性浸潤等，表明糖尿病大鼠出現不同程度的腎結構和功能損害。經柴胡皂苷A干預后，糖尿病大鼠腎臟功能指標24 hUP、SCr、BUN水平降低，腎臟肥大指數降低，受損的腎組織得到明顯改善。表明柴胡皂苷A可有效改善糖尿病大鼠腎臟病理損傷，從而調節糖尿病大鼠的腎臟功能。

既往研究表明，氧化應激是包括糖尿病在內的多種慢性疾病及并發癥的機制之一[21-22]。Sirtuins是保守的III類組蛋白脫乙酰基酶家族，SIRT3是該家族中調控細胞增殖和氧化應激的關鍵調節因子，可通過去乙酰化激活超氧化物歧化酶2（SOD2）和叉頭框轉錄因子O3（FOXO3）的轉錄表達來保護細胞免受氧化應激損傷、減輕氧化應激導致的線粒體功能障礙[23-25]。IDH2和MnSOD是線粒體內的抗氧化酶，SIRT3可作用于兩者，進而打破細胞內活性氧簇（ROS）穩定，SIRT3的表達缺失將直接導致活性氧簇蓄積，使葡萄糖攝入增加和線粒體氧化轉化[26-27]。本研究結果顯示，糖尿病模型大鼠和高糖誘導的腎小管上皮細胞模型SOD和GSH-Px活性，IDH2、MnSOD和SIRT3的mRNA和蛋白表達水平均較正常組降低，MDA含量升高。柴胡皂苷A在糖尿病模型大鼠和高糖誘導的腎小管上皮細胞模型中上調IDH2、MnSOD和SIRT3的mRNA和蛋白表達，增加抗氧化酶（SOD和GSH-Px）活性、降低組織和細胞中氧化產物（MDA）的蓄積，從而改善糖尿病大鼠腎臟組織線粒體功能和高糖攝取，最終改善糖尿病大鼠的腎臟病理學改變和腎臟功能。

綜上所述，柴胡皂苷A可有效改善糖尿病大鼠腎結構和功能損傷，其機制可能與其增強高糖狀態下腎小管上皮細胞的抗氧化能力、減輕氧化應激反應有關。下一步我們將研究柴胡皂苷A對糖尿病腎病中抗氧化信號通路的調節作用。