芪藶強心膠囊對慢性心力衰竭大鼠心肌巨噬細胞衍生趨化因子表達的影響

劉春紅， 姜德友， 陳飛， 解穎， 王金賀， 王偉明， 孫許濤

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江哈爾濱 150040）

慢性心力衰竭（CHF）是多種病因引起的心肌收縮/舒張功能障礙，是諸多心血管疾病發展到終末期的共同轉歸即終點站，曾被世界心臟病學家Braunwald教授[1]比喻為“心臟病最后的戰斗場”。CHF在世界各地的發病率越來越高，并且隨著年齡的增加患病率亦明顯上升，已成為當今影響人們健康的最主要心血管系統疾病之一[2-3]。目前，西藥在治療CHF方面雖然已取得良好的效果，但CHF的預后仍然較差，如β受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）等盡管能夠很好地抑制心室重塑[4-5]，可對于腎功能不全、藥物禁忌癥或難以耐受藥物的患者來說，其治療仍有較大的局限性。故CHF的預防與治療仍是國內外眾多學者主要研究的問題。芪藶強心膠囊作為近年來中醫藥防治心血管疾病的重要發現之一，其在臨床上已顯示出很好的療效[6-7]。研究表明，芪藶強心膠囊可有效緩解CHF的各種臨床癥狀，具有利尿、強心、擴張血管，抑制腎素—血管緊張素—醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的系統激活、心室重構，改善心功能，延緩CHF病程等作用[8-9]。課題組前期研究亦發現，“巨噬細胞衍生趨化因子（MDC）→趨化因子受體4（CCR4）→G蛋白”通路在CHF的發生發展及治療過程中起到重要作用[10]。因此，為進一步指導臨床用藥，本研究觀察了芪藶強心膠囊對CHF大鼠心肌組織MDC表達的影響，探討其對改善CHF大鼠心功能的作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物60只清潔級健康雄性Wistar大鼠，體質量（245±5）g，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，動物質量合格證號：SCXK（遼）2015-0001。飼養于黑龍江中醫藥大學基礎醫學院細胞分子生物實驗室，溫度（25±1）℃，相對濕度（50±5）%，通風及光照良好，環境適宜。適應性飼養1周。

1.2藥物、試劑與儀器芪藶強心膠囊（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號：A1511014）；地高辛片（上海信誼藥廠有限公司，批號：020150808）；阿霉素（adriamycin）（山西普德藥業有限公司，批號：020150703）。大鼠MDC酶聯免疫吸附分析（ELISA）96 Tests試劑盒、PV-6001 PowerVisionTMTwo Step免疫組織化學試劑盒（北京博奧拓達科技有限公司）。顯微攝影成像系統（美國Thermo公司）；UC-7超波切片機（德國Leica公司）；病理圖像分析系統（美國Thermo公司）；JEM-1400PLUS透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；Vivid7彩色超聲診斷儀（美國GE公司）。

1.3分組、造模與給藥從60只大鼠中隨機選取15只作為空白組，其余45只制備CHF模型[11]。方法：用生理鹽水配制成2 mg/mL的阿霉素溶液，按1.5 mg/kg的劑量進行腹腔注射，每周2次，共注射7周，建立CHF大鼠模型。空白組同期注射等體積生理鹽水。將45只成模大鼠隨機分為3組，即芪藶強心治療組、地高辛對照組和模型組，分別對應給予芪藶強心膠囊溶液（劑量為0.09 g/kg，0.09 g即膠囊內容物質量）、地高辛混懸液（劑量為0.019 mg/kg），生理鹽水（3 mL/只）灌胃，每天3 次[10]，共灌胃28 d。

1.4大鼠超聲心動圖觀察所有大鼠末次灌胃禁食12 h后，腹腔注射30 g/L戊巴比妥鈉溶液（0.2 mL/kg）進行麻醉。成功麻醉之后，將大鼠仰臥固定于操作臺。用剃毛器除去大鼠胸前毛發，充分暴露胸部。采用10 s探頭的Vivid7彩色超聲儀，探頭頻率為7～12 mHz。將涂抹耦合劑的探頭置于大鼠胸骨左緣，對大鼠進行心臟超聲掃查。分別測量左心室舒張末期內徑（LVIDd）、左心室收縮末期內徑（LVIDs）、左心室短軸縮短率（FS）、射血分數（EF）等指標，測量3次，取其平均值。

1.5大鼠心臟血流動力學指標檢測大鼠心臟彩色超聲檢查后，用玻璃針慢慢將大鼠右側頸總動脈剝離，徹底暴露動脈后用手術線將遠心端頸動脈結扎；再向近心端方向插管，經壓力轉換器連接BL-420S生物機能實驗系統，分別檢測左心室收縮/舒張末期壓力（LVSP/LVEDP）、左心室內壓最大變化速率（±dp/dtmax）等指標。

1.6標本的采集及保存上述實驗完成后，沿正中線切開胸壁，暴露出心臟后迅速摘取心臟，用冰鹽水沖洗干凈，去除多余水分后切取適量左心室組織，用電鏡液保存，其余部分置于液氮中保存備用。

1.7大鼠心肌組織病理形態學觀察

1.7.1 蘇木素—伊紅（HE）染色 將左心室組織放入體積分數4%甲醛溶液中固定，常規脫水后石蠟包埋，連續切片厚度約4μm，HE染色，觀察心肌形態結構變化。

1.7.2 透射電鏡 取心肌組織用體積分數2.5%戊二醛溶液（pH=7.0）固定，磷酸鹽緩沖液漂洗6次，10 g/L鋨酸固定后梯度脫水，包埋、固化、切片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛進行雙重染色。應用透射電鏡觀察，攝片。

1.8大鼠心肌組織MDC表達和含量測定

1.8.1 免疫組織化學法 按照PV-6001PowerVisionTMTwo Step試劑盒說明進行免疫組織化學染色。顯微鏡下每張切片隨機挑選6個視野，用Image-pro plus 5.0圖像分析系統測定MDC陽性積分光密度（IOD），取其平均值表示MDC表達水平。

1.8.2 ELISA法 心肌組織加入適量緩沖液進行研磨離心，取上清，按照MDCELISA 96 Tests試劑盒方法對濃度已均衡的左室心肌組織MDC含量進行檢測。

1.9統計方法采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，進行正態性和方差齊性檢驗，多組比較采用單因素方差分析。進一步兩兩比較，若方差齊，采用Bonferroni檢驗，若方差不齊，采用Dunnett T3檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠超聲心動圖觀察指標比較圖1結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠超聲心動圖參數LVIDd、LVIDs明顯升高，EF、FS明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，芪藶強心治療組、地高辛對照組超聲心動圖參數LVIDd、LVIDs下降，EF、FS上升，差異均有統計學意義（P＜0.05）；芪藶強心治療組LVIDd、LVIDs、EF、FS與地高辛組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠超聲心動圖觀察指標比較（±s）Figure 1 Comparison of the indexes observed by analysis of ultrasonic cardiogram in rats of various groups（-x ± s）

2.2各組大鼠心臟血流動力學變化比較圖2結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低，LVEDP明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，芪藶強心治療組LVEDP明顯下降，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；芪藶強心治療組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVEDP與地高辛對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠心臟血流動力學指標比較（±s）Figure 2 Comparison of the cardiac haemodynamics indexes in rats of various groups（± s）

2.3各組大鼠心肌組織病理形態學變化比較

2.3.1 HE染色結果 圖3結果顯示：空白組心肌細胞排列整齊，胞核染色無固縮，胞質染色無腫脹，間質無擴張充血和炎細胞浸潤；模型組大鼠心肌纖維組織排列明顯紊亂，部分心肌胞核固縮深染，胞漿腫脹斷裂濃染，間質增生充血并可見炎癥細胞浸潤；芪藶強心治療組和地高辛對照組大鼠心肌組織病理形態較模型組均有不同程度改善，心肌纖維排列相對規整，胞核固縮數目明顯減少，胞質腫脹明顯減輕，間質無明顯增生，無明顯炎癥細胞浸潤。

2.3.2 透射電鏡結果 圖4結果顯示：空白組心肌組織正常；模型組心肌組織內肌原纖維走形紊亂，肌節斷裂，長短不一，肌絲灶性溶解、消失。核膜斷裂，核固縮，肌漿網囊性擴張，核內可見空泡樣變，壞死的心肌細胞附近出現成束的膠原纖維增生；芪藶強心治療組和地高辛對照組大鼠心肌較模型組大有改善，肌原纖維排列相對整齊，肌節發育較好，肌絲結構尚可，心肌組織間質及核周圍結構基本正常，無水腫。

圖3 各組大鼠心肌組織HE染色結果比較（×400）Figure 3 Comparison of HE staining results of myocardial tissue in rats of various groups（× 400）

2.4各組大鼠心肌組織MDC含量和表達比較圖5～7結果顯示：與空白組比較，模型組MDC含量和表達顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，芪藶強心治療組與地高辛對照組MDC含量和表達顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；芪藶強心治療組MDC含量和表達與地高辛對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠心肌組織透射電鏡結果比較（×5 000）Figure 4 Comparison of transmission electronmicroscopical results of myocardial tissue in rats of various groups（× 5 000）

圖5 各組大鼠心肌組織MDC含量比較（ELISA法，±s）Figure 5 Comparison of MDC content in rat myocardial tissue in various groups（by ELISA， -x±s）

3 討論

本研究結合超聲心動圖、心臟血流動力學各項指標及光學顯微鏡結果，證明慢性心力衰竭（CHF）大鼠模型復制成功。而芪藶強心膠囊對CHF大鼠心臟超聲心動圖及心臟血流動力學中各項指標有明顯的改善作用，但恢復程度不及空白組，表明芪藶強心膠囊可有效改善CHF大鼠心功能，但阿霉素致心臟損傷已不可逆。

圖6 各組大鼠心肌組織MDC陽性細胞分布比較（免疫組織化學法，×400）Figure 6 Comparison of the MDC-positive cell distribution in rat myocardial tissue in various groups（by immunohistochemistry，× 400）

圖7 各組大鼠心肌組織MDC表達比較（免疫組織化學法，±s）Figure 7 Comparison of MDC expression in rat myocardial tissue in various groups（by immunohistochemistry，±s）

趨化因子是一類對白細胞有化學趨化作用的細胞因子，具有促細胞骨架重新排列引起細胞形態改變，促肌動蛋白板層足形成和退縮，升高活化白細胞內游離Ca2+濃度以及促進胞內顆粒內容物的釋放等功能[12]。趨化因子主要分為4個亞家族，即CL、CCL、CXCL及CX3CL，目前已發現50余種。其中MDC，又稱為CCL22，是CCL類趨化因子之一，其與胸腺活化調節因子（TARC）的基因編碼位點相同，二者有32%相似的基因序列，并且都能夠識別CC趨化因子受體4（CCR4）[13]。有研究表明，CCR4是G蛋白偶聯受體，是公認的MDC受體。CHF發病過程中，由于抑制性G蛋白（Gi）增加、激動性G蛋白（Gs）降低、β1受體下調，從而導致Gs與β腎上腺素受體耦聯障礙；另外，細胞內cAMP含量下降，導致肌漿網（SR）對Ca2+的攝取和釋放障礙，最終影響心肌的舒縮功能。當MDC與CCR4受體特異性結合后，一方面激活G蛋白，使Ca2+活化，促進Ca2+細胞內流，增加細胞內Ca2+濃度而加強心肌收縮功能，另一方面又可以誘導磷酸接納蛋白的磷酸化，從而促進肌漿網對Ca2+的攝取而改善心肌的舒張[14-19]。本課題組前期通過對CHF大鼠靶基因預測研究發現，MDC-CCR4相關的生物學通路達15種，其中包括“MDC→CCR4→G蛋白”通路[20]。而在本研究中結果顯示：與空白組比較，模型組MDC含量和表達水平下調（P＜0.05）；與模型組比較，芪藶強心治療組和地高辛對照組MDC含量和表達顯著增高（P＜0.05），且2個治療組比較差異無統計學意義（P＞0.05），提示芪藶強心膠囊可有效改善大鼠CHF，其機制可能與調節MDC蛋白含量和表達進而提高心功能有關。

綜上所述，芪藶強心膠囊可能通過調節心肌MDC含量和表達而改善心肌舒縮功能，對CHF大鼠心臟起保護作用。