膀胱尿路上皮癌組織中CIAPIN1、Fibulin-3的表達變化及意義

季拓，蔣政干，王祺，常寶元

安徽省宿州市立醫(yī)院，安徽宿州 234000

膀胱尿路上皮癌是最常見的膀胱癌之一，主要起源于上皮組織的常見泌尿系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率、復(fù)發(fā)率及病死率高。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計[1]，我國男性膀胱尿路上皮癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第7位，較女性多見，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢。凋亡抑制因子1(CIAPIN1)屬于細胞死亡抑制因子，其位于染色體 16q13，內(nèi)含7個內(nèi)含子和8個外顯子[2]。研究[3]表明，CIAPIN1能激活受體依賴性激酶Ras信號通路，抑制細胞凋亡的同時促進細胞增殖。此外，CIAPIN1通過靶向作用于MMPs，進而調(diào)控ERK1/2信號通路，加速癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。Fibulin-3又稱EFEMP1，屬于細胞外基質(zhì)糖蛋白，主要存在于上皮細胞基膜、內(nèi)皮細胞基膜及密集間充質(zhì)中，能維持細胞外環(huán)境的穩(wěn)定性和完整性[4]。Fibulin-3是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的重要組成蛋白，通過調(diào)控微環(huán)境與細胞的相互作用，進而對腫瘤細胞的增殖、分化及遷移產(chǎn)生影響[5]。目前，CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱尿路上皮癌中研究較少，其作用機制及相關(guān)性尚不清楚。本研究旨在探討膀胱尿路上皮癌組織中CIAPIN1、Fibulin-3的表達，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月～2019年3月我院收治的73例膀胱尿路上皮癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合《世界衛(wèi)生組織腫瘤分類診斷系統(tǒng)》[6]中的診斷原則且術(shù)后病理證實為尿路上皮癌；②均首次診斷為膀胱尿路上皮癌，且既往無膀胱手術(shù)史及放化療史；③患者的基本信息齊全，且愿意協(xié)助本次試驗。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并輸尿管或膀胱結(jié)核者；②嚴(yán)重尿路感染者；③肝腎功能失代償者；④合并其他原發(fā)惡性腫瘤者。患者男51例、女22例，年齡(59.12±6.93)歲。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者7例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者66例；高分化者43例、中分化者22例、低分化者8例;腫瘤直徑≤5 cm者40例，>5 cm者33例；TNM分期Ⅰ期41例、Ⅱ期20例、Ⅲ期9例、Ⅳ期3例。本研究通過我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 膀胱尿路上皮癌及其相應(yīng)癌旁正常組織中CIAPIN1、Fibulin-3表達檢測 采用qRT-PCR法。將術(shù)中取樣的癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)暫存于液氮中，術(shù)后迅速移至-80 ℃冰箱中保存。兩種組織均取50 mg，在冰上研磨后，各加入1 mL TRIzol試劑(Invitrogen公司)，嚴(yán)格遵循操作流程提取總RNA。采用Prime ScriptTMRT reagent kit試劑盒(TaKaRa公司)將10 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(TaKaRa公司)測量CIAPIN1和Fibulin-3的相對表達量。CIAPIN1和Fibulin-3的反應(yīng)條件均為25 ℃ 10 min，37 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min。CIAPIN1正向引物：5′-GAGCTGCTGGATCCAGAAGATTTGAAG-3′,反向引物：5′-CAGGTAGCAGTTTCCACAAGCTGAC-3′;內(nèi)參基因GAPDH正向引物：5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGTATGAC-3′,反向引物：5′-GTGGTCATGAGTCCTTCCACGATACC-3′；Fibulin-3正向引物：5′-TGTATGTGCCCCCAGGGATA-3′,反向引物：5′-AACGGAAGCCGCCATGATAA-3′;內(nèi)參基因GAPDH正向引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,反向引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。CIAPIN1和Fibulin-3的PCR反應(yīng)條件均為95 ℃ 3 min、變性94 ℃ 30 s、退火56 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 45 s，共反應(yīng)40 個循環(huán)，每個樣本檢測次數(shù)均為3次。以上引物序列均由上海生工公司制作合成。通過相對Ct值法檢測二者表達量，結(jié)果采用 Ct值表示，CIAPIN1和Fibulin-3的表達量相對于GAPDH的比值為2-ΔΔCt，其中 Ct= C目的基因-Ct內(nèi)參基因。

2 結(jié)果

2.1 膀胱尿路上皮癌及癌旁正常組織中CIAPIN1和Fibulin-3表達比較 膀胱尿路上皮癌組織及癌旁正常組織中CIAPIN1的相對表達量分別為4.67±1.02、1.98±0.67，而Fibulin-3的相對表達量分別為5.41±1.53、1.82±0.56。膀胱尿路上皮癌組織中CIAPIN1和Fibulin-3的相對表達量均較癌旁正常組織中增加(t分別為18.833、18.826，P均為0.000)。

2.2 膀胱尿路上皮癌組織中CIAPIN1和Fibulin-3表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 膀胱尿路上皮癌組織中CIAPIN1和Fibulin-3表達與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，而與患者性別、組織分化程度、腫瘤直徑及年齡無關(guān)(P均>0.05)，見表1。

表1 膀胱尿路上皮癌組織中CIAPIN1和Fibulin-3表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 膀胱尿路上皮癌組織中CIAPIN1和Fibulin-3表達的關(guān)系 膀胱尿路上皮癌組織中CIAPIN1和Fibulin-3表達呈正相關(guān)(r=0.797，P=0.000)。

3 討論

膀胱尿路上皮癌屬于常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其在膀胱癌的發(fā)病率和病死率均居首位，且近年發(fā)病率呈增長趨勢[7]。膀胱尿路上皮癌的主要病理分型是移行上皮細胞癌，其中非肌層浸潤性膀胱癌約占70%[8]。膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多步驟及多因素共同協(xié)調(diào)的過程，其中染色體畸變、基因突變以及表觀遺傳修飾均起到重要作用[9]。目前，膀胱尿路上皮癌的治療主要是膀胱全切術(shù)或經(jīng)尿道電切術(shù)，并聯(lián)合藥物化療及免疫治療，然而膀胱尿路上皮癌的復(fù)發(fā)率極高且易于進展為肌層浸潤性膀胱尿路上皮癌，因此手術(shù)治療效果并不理想[10]。近年來，隨著膀胱癌分子機制研究的不斷深入，原癌基因與抑癌基因活性的失調(diào)、DNA甲基化及組蛋白修飾均對膀胱癌的發(fā)生進展產(chǎn)生重要影響，已成為目前研究的熱點。

CIAPIN1是一種細胞死亡抑制因子，其長度約為939 bp，主要分布于核仁中，由C-末端中的鋅指樣結(jié)構(gòu)和N-末端中的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)構(gòu)成[11]。CIAPIN1能調(diào)控細胞有絲分裂進程，縮短G1/S期，加速腫瘤細胞的分裂和增殖[12]。研究[12]表明，抑制CIAPIN1表達能減緩血管內(nèi)皮細胞增殖速度，降低癌組織中供血血管密度，進而阻礙癌細胞的分化和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，膀胱尿路上皮癌組織中CIAPIN1的表達高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。原因可能為癌組織中的生長因子(如紅細胞生成素、白細胞介素-3及干細胞因子)表達增加，進而刺激CIAPIN1，使其在癌組織中表達上調(diào)[13]。此外，癌組織中的RAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，通過正反饋調(diào)節(jié)CIAPIN1表達量增加[14]。本研究結(jié)果顯示，膀胱尿路上皮癌組織中CIAPIN1的表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且惡性度越高，其表達量越高，表明CIAPIN1在膀胱尿路上皮癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。其原因可能為CIAPIN1通過激活NF-κB信號通路，從而降解IKBα、磷酸化p65，最終抑制癌細胞凋亡并使癌細胞增殖速度加快[15]。CIAPIN1能促進Jak2和Bcl-xL表達，阻止癌細胞凋亡并增強其耐藥性，有助于癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，CIAPIN1可以通過Cyclin E/CDK2和Cyclin D1/CDK4途徑調(diào)節(jié)G1/S期，促進腫瘤的分裂和分化，提高其惡性程度[16]。

Fibulins屬于細胞外基質(zhì)糖蛋白家族，由C端Fibulin樣結(jié)構(gòu)域和鈣結(jié)合表皮生長因子模塊構(gòu)成。Fibulin-3是一種分泌型糖蛋白，主要位于染色體2p16，包含493個氨基酸和11個外顯子，能維持基底膜、疏松結(jié)締組織及彈性纖維的穩(wěn)定，同時對細胞-細胞和細胞-基質(zhì)間的信號傳導(dǎo)有重要調(diào)控作用[17]。研究[18]表明，在卵巢癌組織中，F(xiàn)ibulin-3能激活部分血管生成因子，進而調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞重組，增強癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果顯示，膀胱尿路上皮癌組織中Fibulin-3的表達高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其原因可能為癌細胞由于基因突變使其無限增殖，進而分泌大量的黏多糖、糖蛋白和膠原蛋白等細胞外基質(zhì)(ECM)物質(zhì)，而Fibulin-3是ECM的一員，因此其表達量在膀胱尿路上皮癌組織中上調(diào)[19]。本研究結(jié)果顯示，膀胱尿路上皮癌組織中Fibulin-3的表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且惡性度越高，其表達量越高。其原因可能為Fibulin-3通過與表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合，使Tyr-1068和Tyr-992磷酸化，進而激活A(yù)KT和p44/p42 MAPK信號通路，加速癌細胞增殖[20]。研究[20]表明，F(xiàn)ibulin-3能調(diào)節(jié)Notch通路，增強基底細胞黏附能力，進而促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，此外，F(xiàn)ibulin-3可上調(diào)基質(zhì)蛋白酶MMP-2/MMP-9及ADAMTS-5的表達，降解ECM，從而為癌細胞轉(zhuǎn)移提供生理條件。

本研究結(jié)果顯示，癌組織中的CIAPIN1表達和Fibulin-3表達呈正相關(guān)關(guān)系，表明CIAPIN1和Fibulin-3協(xié)同作用加速膀胱尿路上皮癌的發(fā)病及演化。其機制可能為Fibulin-3能介導(dǎo)NF-κB通道激活金屬酶AEG-1和MMP-2，促進癌細胞的轉(zhuǎn)移，而CIAPIN1亦能調(diào)控NF-κB信號通路，從而抑制癌細胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤進展。由此可見，二者均通過NF-κB信號通路促進腫瘤惡化。因此CIAPIN1和Fibulin-3可能起到協(xié)同作用，加速膀胱尿路上皮癌的進展[15,21]。

綜上所述，膀胱尿路上皮癌組織中CIAPIN1和Fibulin-3表達增加，二者可能共同促進膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展；檢測二者表達有助于患者病情判斷。