未破裂顱內動脈瘤患者血清miR-126、miR-125b的表達變化及意義

秦浩，張亞波，孫秀英，尹航，莊強

棗莊市立醫院，山東棗莊 277100

未破裂顱內動脈瘤(UIAs)的主要危險是動脈瘤破裂引起顱內出血，發病率較高，具有潛在的致死及致殘風險[1]。盡管UIAs較為常見，但僅有少部分患者出現破裂，對高危動脈瘤破裂的患者應早期診斷，并予以積極預防或治療，減少嚴重并發癥的發生[2]。微小RNA(miRNA)長度為18～25個核苷酸，成熟的miRNA構成RNA誘導的沉默復合物，結合靶基因信使RNA的3′非編碼區，調控靶基因的表達，在發育、分化及衰老等生物過程中均發揮重要的調節作用[3]。有研究表明，miRNA在動脈瘤形成及發展中起重要作用[4]。miR-126基因位于9q34.3，研究發現，miR-126主要表達于血管內皮細胞中，具有調節血管內皮細胞的生物學功能，與血管發生、修復等過程密切相關[5]。動脈瘤的發生與血管平滑肌細胞的異常有關，其凋亡過度可引起血管壁重塑，導致動脈瘤的發生。研究發現，miR-125b能調控血管平滑肌細胞的表型轉化，誘導細胞凋亡，與動脈瘤的發生發展密切相關[6.7]。本研究通過檢測UIAs患者血清miR-126和miR-125b表達，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月～2019年2月我院診治的198例UIAs患者(病例組)。納入標準：①均經腦血管造影或核磁共振血管成像明確診斷為UIAs；②初次診治，既往無手術或藥物治療史；③顱內動脈瘤未破裂。排除標準：①有嚴重的頭部外傷史；②有腦血管卒中病史；③臨床資料不完整。病例組中男112例、女86例，年齡32～77(42.1±5.5)歲。動脈瘤數目：1個138例，2個及以上60例；動脈瘤瘤徑<7 mm者107例，≥7 mm者91例；動脈瘤位置：前循環動脈瘤132例，后循環動脈瘤66例。以同期60例查體健康者作為對照組，均經數字減影血管造影或核磁共振血管成像除外顱內動脈瘤，其中男44例、女16例，年齡30～76(41.9±5.9)歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P均>0.05)。本研究經我院倫理委員會審核批準通過，患者及家屬對本研究均知情理解并簽字。

1.2 血清miR-126和miR-125b檢測方法 采用qRT-PCR法。取病例組入院后第1天、對照組查體時晨起空腹靜脈血5 mL，4 ℃下4 000 r/min，離心10 min，離心半徑10 cm，留取上清-80 ℃冰箱保存。取200 μL樣品，應用TRIzol法提取血清中總RNA，用異丙醇沉淀總RNA后75%乙醇洗滌RNA，4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥RNA，50 μL的DEPC水溶解，Narodrop檢測RNA溶液的濃度及純度，OD260/OD280介于1.8～2.1。以總RNA為模板，進行反轉錄合成cDNA，反轉錄條件：37 ℃ 16 min，84 ℃ 6 s。qRT-PCR反應總反應體系20 μL，模板cDNA 1 μL，Taq聚合酶0.2 μL、正向及反向引物各1 μL、2×SYBR Green mix 1 μL及20 mmol/L dNTPs 1 μL，無RNA酶水14.8 μL。反應條件：96 ℃ 2 min，96 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，70 ℃ 10 s，共40個循環。miR-126正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGTGAGTAAT-3′，反向引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC-

GCATTAT-3′；miR-125b正向引物：5′-GCCGTAAAGTGCTGACAGT-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；內參基因U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物:3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。結果采用相對定量法表示，目的基因miR-126、miR-125b的表達分別相對于內參基因U6的比值為2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.3 血清MMP-9檢測方法 采用ELISA法。取病例組入院后第1天、對照組查體時清晨空腹靜脈血約5 mL，EDTA抗凝，靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，分離血清，-80 ℃保存。實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行，人基質金屬蛋白酶ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。450 nm波長處測各孔的OD值。繪制標準曲線，根據樣本OD值計算對應的濃度值。每個標本重復3次，結果取平均值。

2 結果

2.1 兩組血清miR-126和miR-125b表達比較 病例組血清miR-126、miR-125b相對表達量分別為2.967±0.224、2.156±0.122，對照組分別為0.914±0.113、2.968±0.129。與對照組相比，病例組miR-126相對表達量較高(t=68.340，P=0.000)，而miR-125b相對表達量較低(t=44.562，P=0.000)。

2.2 病例組血清miR-126和miR-125b表達與患者臨床特征的關系 見表1。

表1 病例組血清miR-126和miR-125b表達與患者臨床特征的關系

2.3 病例組血清miR-126、miR-125b表達與血清MMP-9水平的關系 病例組及對照組血清MMP-9分別為(551.27±78.93)、(539.25±72.87)ng/mL，兩組間比較差異無統計學意義(t=1.015，P=0.294)。病例組血清miR-126表達與血清MMP-9呈正相關(r=0.715，P=0.000)，而miR-125b表達與血清MMP-9呈負相關(r=-0.625，P=0.000)。

3 討論

既往研究發現，血流動力學參數、動脈瘤形態特征等指標在顱內動脈瘤破裂中起重要作用[8]。近年來發現，動脈瘤的發生機制是由于血管平滑肌細胞產生的細胞外基質和內彈性層產生和降解之間的不平衡，導致腦血管炎癥的發生，進而誘導動脈瘤的起始、形成、生長和隨后的破裂[9]。miRNA與血管炎癥的調節關系密切，并且在顱內動脈瘤的發生發展中起重要作用，有研究發現，顱內動脈瘤患者血清中如miR-126、miR-125b等miRNA異常表達，其可通過調控負責降解血管內彈性層成分(蛋白聚糖、彈性蛋白等)MMP-9的表達，影響顱內動脈瘤的發生發展[10]。

miR-126基因位于人類9號染色體，主要表達于血管內皮細胞中，成熟的miR-126能參與調控血管細胞黏附分子1的表達，影響血管內皮細胞的增殖，參與血管的生成、發育、修復及重塑等生物學功能[11]。本研究中，病例組血清miR-126表達高于對照組，差異有統計學意義，表明miR-126參與UIAs的發生發展，其原因可能是顱內動脈瘤發生時，脈管系統的重新激活促進血管的生成過程，從而促進miR-126的表達，而miR-126能通過抑制出芽相關蛋白的表達，促進血管內皮生長因子的表達，促進血管的生成過程[12]。此外，miR-126表達與UIAs的數目及直徑有關，表明miR-126可能參與促進顱內動脈瘤發生發展。在動脈瘤發生過程中，MMP-9可通過降解Ⅳ型膠原蛋白，發揮促進血管內皮細胞遷移的作用。本研究中，病例組血清miR-126與MMP-9表達呈負相關，其機制可能是miR-126對負調控MMP-9的信號通路有關。有研究表明，miR-126能通過抑制Akt/p53信號通路，負性調控p53基因的表達[13]，而p53能負性調控MMP-9的表達，因而miR-126表達升高促進MMP-9表達[14]。

miR-125家族是進化過程中高度保守的miRNA家族，由miR-125a、miR-125b等成員組成，miR-125家族的異常表達與炎癥、免疫及腫瘤等疾病的發生發展密切相關[15]。研究表明，miR-125b是一種腫瘤抑制因子，在腹主動脈瘤中存在異常表達下調的現象，參與血管壁炎癥與抗炎平衡的調節[16]。本研究中，病例組血清miR-125b的表達低于對照組，差異有統計學意義，其機制可能是長鏈非編碼RNA(LncRNA)如MALAT1對miR-125b的表達抑制作用有關。研究發現，LncRNA MALAT1能作為分子海綿結合并抑制miR-125b的表達，導致miR-125b水平降低[17]。此外，miR-125b表達與UIAs的數目及直徑有關，其原因可能是miR-125b能抑制下游靶標包括STAT3等轉錄因子的表達，STAT3結合于MMP-9的啟動子區減少，MMP-9的水平降低，而UIAs時miR-125b表達降低后導致MMP-9水平升高，MMP-9降解顱內動脈血管內彈性層，導致UIAs的數目增多及直徑增大[18]。

綜上所述，UIAs患者血清中miR-126表達升高，miR-125b表達降低；檢測二者表達有助于判斷UIAs數目和直徑。