膿毒癥患兒外周血miR-146a、miR-223的水平變化及意義

楊家偉，胥亞福，謝新

阿壩藏族羌族自治州人民醫院，四川阿壩州 624000

膿毒癥是臨床常見的全身性炎癥反應綜合征，主要由感染等因素造成宿主免疫反應失調而導致的致命性器官功能障礙，本質為機體過度免疫反應造成的炎癥反應損傷自身[1,2]。膿毒癥的發病率和致死率均較高，每年有將近1 800萬新發膿毒癥患者，膿毒癥能誘發膿毒癥休克、多器官功能衰竭綜合征，甚至導致患者死亡，其發病機制尚未明確[3,4]。盡管醫學診療技術不斷發展，但仍未有效降低膿毒癥的發病率和病死率，反而以每年8.7%的發病率遞增，給患者家庭及社會造成沉重的經濟負擔[5]。微生物培養曾被認為是診斷膿毒癥的“金標準”，但耗時長，準確率僅50%左右，并不利于膿毒癥早期診療[6]。近年研究發現，生物標志物可用于診斷和治療膿毒癥，微小RNA(miRNA)廣泛存在于真核細胞，具有高度保守的特點，能夠微調機體免疫功能，其中miR-146a是第一個被發現影響機體免疫炎癥反應的miRNA[7]，同時發現miR-223能影響膿毒癥患者的免疫炎癥反應[1]，但兩者對膿毒癥患兒的臨床意義并未做全面研究。本研究通過探討膿毒癥患兒外周血miR-146a、miR-223水平變化及臨床意義，旨在為膿毒癥診療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年3月～2019年7月收治的膿毒癥患兒77例作為研究組，患兒診斷均參考2012版膿毒癥國際指南診斷標準[8]，存在高度可疑的感染灶，同時符合SIRS的診斷標準。納入標準：①臨床資料完整，且依從性高；②經患兒家屬同意，并簽署知情同意書。排除標準：①入院24 h內即出院的患兒；②發病時間超過72 h；③合并患有先天性畸形、結締組織病等；④合并心、肝、腎等重大臟器病變；⑤中途退出研究。入組患兒中男42例、女35例，年齡6～15(10.63±2.52)歲。治療后轉歸情況：生存期≥28 d者50例(生存組)，生存期<28 d者27例(死亡組)。同時選擇全身性炎癥反應綜合征(SIRS)患兒65例(SIRS組)，其中男37例、女28例，年齡6～14(10.51±2.39)歲。SIRS診斷參考文獻[8]標準：①體溫超過38 ℃或低于36 ℃；②心率超過90次/min；③呼吸頻率超過20次/min或二氧化碳分壓低于32 mmHg；④外周血白細胞計數超過12.0×109/L或低于4.0×109/L。符合以上至少兩項臨床診斷標準即被診斷為SIRS。另選擇同期于我院體檢健康的兒童68例作為對照組，其中男37例、女31例，年齡7～14(10.36±2.41)歲。三組受試者的平均年齡及性別比較差異無統計學意義(P均>0.05)。本研究通過我院醫學倫理委員會批準。

1.2 樣本采集 膿毒癥患兒于入住重癥監護室后，采集外周靜脈血5 mL，SIRS患兒于術后24 h內采集外周靜脈血5 mL，對照組于體檢日采集外周靜脈血5 mL，置于涂有乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝的采血管中，3 500 r/min離心10 min，離心半徑為13 cm，分離上清液，即得血漿，置于-80 ℃冰箱中備用待測。

1.3 外周血miR-146a和miR-223表達測定 采用qRT-PCR法。取出血漿解凍，采用TRIzol總RNA提取試劑(購自美國Invitrogen公司)提取血漿中總RNA，嚴格按照說明書進行操作，使用紫外分光光度計測定總RNA的吸光度(A260和A280)，并計算A260/A280，若值在1.8～2.0，表示提取的總RNA純度高，反之，純度不高，需要重新提取。提取總RNA后，使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，產生cDNA，擴增過程在聚合酶的作用下進行，擴增條件：95 ℃維持5 min，95 ℃變性 15 s；60 ℃退火60 s；72 ℃延伸30 s。共計進行40個循環，最后使用StepOne Plus熒光定量PCR儀(美國ABI公司提供)進行檢測，對照設置為U6RNA，每個反應包括3個復孔，計算平均值。

1.4 血漿中炎性因子檢測 采用酶聯免疫吸附法檢測血漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6、IL-10及C-反應蛋白(CRP)水平，試劑盒購自美國R&D公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 急性生理學與慢性健康狀況評分系統Ⅱ評分[9]評價 APACHEⅡ評分包括三部分，即急性生理評分、年齡評分及慢性健康評分。急性生理評分包括12項生理指標，每項分值為0～4分，選擇入住重癥監護室最初24 h內的最差值。年齡分值為0～6分，慢性健康評分為2～5分。最終得分為三項總分，理論最高得分71分。分數越高，預后效果越差。

2 結果

2.1 三組外周血miR-146a、miR-223表達及炎性因子水平比較 三組外周血miR-146a、miR-223表達及炎性因子水平間差異有統計學意義(P均<0.05)。研究組和SIRS組外周血miR-146a、miR-223表達及血漿TNF-α、IL-6、IL-10及CRP水平均高于對照組，同時研究組外周血miR-146a、miR-223表達及炎性因子水平高于SIRS組(P均<0.05)，見表1。

表1 三組外周血miR-146a、miR-223表達及炎性因子水平比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與SIRS組相比，#P<0.05。

2.2 不同轉歸患兒外周血miR-146a、miR-223表達和APACHEⅡ評分、炎性因子水平比較 死亡組外周血miR-146a、miR-223表達及血漿TNF-α、IL-6、IL-10、CRP水平和APACHEⅡ評分均高于生存組(P均<0.05)，見表2。

2.3 外周血miR-146a和miR-223表達與炎性因子

表2 不同轉歸患兒外周血miR-146a、miR-223表達、APACHEⅡ評分及炎性因子水平比較

水平和APACHEⅡ評分的相關性 外周血miR-146a與TNF-α、IL-6、IL-10、APACHE Ⅱ評分呈正比(r分別為0.693、0.522、0.403、0.507，P均<0.05)，而與CRP無相關性(r=0.132，P>0.05)；外周血miR-223與TNF-α、IL-10、CRP和APACHE Ⅱ評分呈正比(r分別為0.516、0.432、0.501、0.531，P均<0.05)，而與IL-6無相關性(r=0.178，P>0.05)。

2.4 外周血miR-146a、miR-223表達對患者預后的預測價值 外周血miR-146a、miR-223表達預測患者預后的ROC曲線下面積分別為0.761、0.748，理論閾值分別為5.8、13.0，約登指數分別為0.504、0.467，靈敏度分別為0.776、0.715，特異度分別為0.728、0.752；miR-146a、miR-223聯用對患者預后預測的靈敏度和特異度分別為0.852(23/27)、0.880(44/50)，約登指數為0.732。

3 討論

我國膿毒癥發病率每年仍以8%的速度增長，早期診斷和治療對降低膿毒癥的病死率有重要意義[6]。如果早期未給予膿毒癥患兒及時治療，可能進一步發展為膿毒性休克及器官功能障礙綜合征，成為兒科重癥監護室危重癥患兒死亡的重要原因之一[10]。目前認為膿毒癥的發病機制主要包括：全身炎癥反應、免疫功能障礙、組織損傷、凝血功能異常及宿主對外源微生物的異常反應等[11]。機體在膿毒癥早期為了抵御外界感染及組織損傷等，巨噬細胞、內皮細胞、中性粒細胞及淋巴細胞產生大量的炎性因子，包括TNF-α、IL-6、IL-10等[12]。miRNA是機體內源性單鏈非編碼小RNA分子，參與細胞的發育、分化、增殖、代謝、凋亡及應激等，同時調節炎性因子的表達[10,13]。膿毒癥發展過程中，機體的免疫功能紊亂，越來越多的研究發現，miRNA影響膿毒癥的發生發展，其中miR-146a和miR-223通過調控炎癥和免疫反應而發揮作用[14]。早期研究發現，膿毒癥患者血漿中miR-146a和miR-223表達異常，且有高度的靈敏度和特異性，推測兩者可能是診療膿毒癥的生物標志物[13,15]。

本研究結果發現，膿毒癥患兒、SIRS患兒及健康兒童外周血miR-146a、miR-223表達及炎性因子水平逐漸降低，說明外周血miR-146a、miR-223和炎性因子參與膿毒癥的發生發展，同時組間差異有統計學意義，進一步說明外周血miR-146a、miR-223表達及炎性因子水平可能對于區分膿毒癥和SIRS具有指導意義。另外，生存組外周血miR-146a、miR-223、炎性因子及APACHEⅡ評分均低于死亡組，差異有統計學意義，與侯果等[16]研究結論相符。相關性研究結果顯示，外周血miR-146a、miR-223與炎性因子和APACHEⅡ評分密切相關，提示外周血miR-146a和miR-223可能通過影響炎性因子水平而參與膿毒癥的發生發展。推測其中的原因與miR-146自身性質有緊密聯系。miR-146包括miR-146a和miR-146b，不同來源miR-146a和miR-146b的基因定位不同，兩者的5′端關鍵序列相同，而3′端的2個堿基有差異，從而使其發揮的作用不同[6]。抗炎和促炎反應失衡是誘發膿毒癥的重要發病機制，miR-146a作用于TLR-NF-κB信號通路上的多個靶點，如IL-8、TRAF6、FADD、CCL5、IRAK1、IRAK2等，影響免疫細胞的分化及凋亡過程，從而負反饋調節免疫炎癥反應[6,17]，同時miR-146a通過調節內毒素耐受程度從而控制炎癥反應，減少對機體的損傷[6]。另外，miR-146a能加速轉錄抑制因子Rel B與TNF-α啟動子結合進程，形成異染色質，進而直接抑制炎性因子的轉錄過程，同時抑制Ago2和RBM4的相互作用，從而形成mi RISC復合體，阻斷TNF-α蛋白的翻譯[18]。miR-223是最近被鑒定的小干擾RNA，且膿毒癥患者血漿中miR-223水平異于常人，缺失miR-223則加重膿毒癥誘發的炎癥反應和心功能障礙，推測血漿miR-223可能是膿毒癥的生物標志物[19,20]。miR-223和IKK-α基因的3′UTR互補，巨噬細胞集落刺激因子刺激人單核細胞發生分化時，miR-223水平下降，同時IKK-α水平升高，加重機體的炎癥反應，調節免疫機制[21]。miR-146a和miR-223通過不同的作用機制影響膿毒癥患兒的炎癥反應，從而在不同轉歸結果的患兒得到體現，進一步證明，miR-146a和miR-223可作為反映膿毒癥患兒病情發展的生物學指標之一。進一步ROC曲線結果顯示，miR-146a和miR-223對膿毒癥患兒近期預后的靈敏度和特異度均高于0.7，而聯合預測的靈敏度和特異度分別為0.852、0.880，早期檢測外周血miR-146a和miR-223水平可預測患兒的近期預后，以指導臨床對應診治，提高患兒預后。

綜上所述，膿毒癥患兒外周血miR-146a、miR-223表達異常升高，與患兒炎性因子狀態、病情發展及轉歸密切相關，檢測外周血二者水平有助于預測患兒近期預后。