下調LncRNA SNHG3表達對人胃癌細胞MGC-803增殖、侵襲、凋亡的影響及機制

谷建斌，張國欣，張玉斌，張景承，王雪平，薛菲

石家莊市第一醫院，石家莊050011

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一，預后相對較差，嚴重威脅人類健康。2012年全球胃癌新發病例約50%的病例發生在亞洲東部，主要集中在中國[1]。2015年中國胃癌新發病例約為67.9萬例，胃癌死亡病例約為49.8萬例，是嚴重危害中國居民健康的主要疾病[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA) 指長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，近年來研究結果顯示，在腫瘤組織和正常組織中有一系列差異表達的LncRNA[3，4]，在多種腫瘤如胃癌、乳腺癌、結腸癌的發生發展、轉移及復發過程中發揮重要作用[5～7]。核仁小分子RNA宿主基因3(SNHG3)是一種LncRNA，位于染色體1p35.3。我們在實驗中發現，LncRNA SNHG3在胃腺癌組織中異常高表達[8]，提示其異常表達可能與胃癌的發生和惡性進展密切相關。2017年10月～2018年12月，本研究通過 siRNA 技術下調胃癌細胞MGC-803中LncRNA SNHG3表達，探討LncRNA SNHG3表達變化對胃癌細胞MGC-803增殖、侵襲和凋亡的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 正常胃黏膜上皮細胞GES1由河北醫科大學第四醫院科研中心提供；人胃癌細胞MGC-803購于中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心。SNHG3-siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。LncRNA SNHG3、β-actin引物使用Primer 5軟件設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。Roter gene 3000(澳大利亞Corbett公司)；NanoDrop ND-2000分光光度計(美國NanoDrop公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；BD Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)；M-MLV反轉錄試劑盒(美國Promega公司)；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(全式金公司)；Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)；goat anti rabbit IgG(H+L)，HRP(美國Jackson)；ECL(美國Millipore公司)。

1.2 細胞培養 將人胃癌細胞MGC-803及正常胃黏膜上皮細胞系GES1均接種于RPMI 1640培養基，于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養，48 h后消化傳代。

1.3 LncRNA SNHG3表達檢測 采用qRT-PCR法。取對數生長期胃癌細胞MGC-803及正常胃黏膜上皮細胞GES1，采用qRT-PCR試劑盒檢測LncRNA SNHG3表達。LncRNA SNHG3正向引物:5′-AGACAGATTCGCAGTGGTCG-3′，反向引物:5′-GTCTCCATGGCCCACTTCTG-3′。β-actin正向引物：5′-CACCCCAGCCATGTACGTTG-3′，反向引物：5′-AATGTCACGCACGATTTCCC-3′。采用定量2-△△CT法計算胃癌細胞LncRNA SNHG3相對表達量。

1.4 細胞分組及轉染 將對數生長期的人胃癌細胞MGC-803,隨機分為SNHG3-siRNA 組、陰性對照組和空白對照組，每組設 3 個復孔。各組常規培養24 h，SNHG3-siRNA 組加入LncRNA SNHG3 siRNA(正向引物:5′-GCAUUUAGCUAGGAAUGCATT-3′，反向引物:5′-UGCAUUCCUAGCUAAAUGCTT-3′)轉染，陰性對照組加入無關序列 NC siRNA(正向引物:5′-ACUGCGACUGCUUCACUUGTT-3′，反向引物:5′-CAAGUGAAGCAGUCGCAGUTT-3′)轉染，空白對照組不予轉染。所有操作嚴格按 Lipofectamine2000說明書進行。轉染24 h，提取細胞總RNA，按照M-MLV反轉錄試劑盒說明逆轉錄為cDNA，以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增。根據 SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明配制反應體系20 μL。反應條件:95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s共40個循環。

1.5 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將轉染24 h的三組細胞消化制成單細胞懸液，以5×103個/孔種植于96孔板(100 μL/孔)，在培養24 h 時每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續培養1 h，在450 nm波長下，用酶標儀測定各孔光密度(OD)值。

1.6 克隆形成率測算 采用平板克隆實驗。將細胞接種于6孔板(300個/孔)，置于培養箱中培養1～2周，觀察克隆細胞形成至合適大小時用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，加入適量0.1%結晶紫染色液染色10 min，倒置顯微鏡下觀察5個視野，計數細胞的克隆數。克隆形成率(%)=克隆數目/接種細胞數×100%。

1.7 細胞遷移能力檢測 采用Transwell小室實驗。取各組細胞，均計數5×104個細胞加入Transwell小室上室中，用無血清培養液正常培養，小室下加入含10%血清的DMEM培養液。培養48 h，將小室取出用PBS沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色液染色20 min。顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個視野計數穿膜細胞數，每組設3個復孔，取平均值。

1.8 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室實驗。Transwell小室上室用50 μL Matrigel膠包被，在37 ℃中放置3～5 h。各組分別取200 μL(密度為2.5×105個/mL)細胞接種于Transwell小室上室，在下室加入DMEM培養基。培養48 h后擦去上室的Matrigel膠和多余細胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色液染色，隨機選取5個視野計數穿膜細胞數，每組設3個復孔，取平均值。

1.9 細胞周期及凋亡檢測 應用流式細胞術進行細胞周期分析，通過標準胰蛋白酶消化程序收獲生長對數期的轉染和對照細胞，用 PBS 洗滌，加入PI染液500 μL和破膜劑5 μL，室溫避光孵育30 min，收集培養物并使用BD Accuri C6流式細胞儀分析細胞周期。統計G0/G1、S和G2/M期細胞的百分比。按照細胞凋亡檢測試劑盒說明，將細胞每管加入Annexin V-FITC 5 μL和10 μL 20 μg/mL PI溶液，室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀測定并獲取細胞凋亡比例。

1.10 信號傳導與活化轉錄因子3(STAT3)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、c-Myc和p-STAT3蛋白表達檢測 應用蛋白質印跡(Western blotting)法測定。使用 RIPA 緩沖液提取總細胞裂解物，通過配置12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，恒壓80 V，2 h)分離蛋白質，并轉移到 PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉，并在4 ℃下與一抗孵育過夜。緩沖液洗膜(15 min×3次)，將膜與二抗孵育，最后用 ECL底物試劑盒檢測，實驗重復3次。采用Bio-Rad Image Lab 5.2.1軟件進行灰度分析。

2 結果

2.1 人胃癌細胞MGC-803中各組LncRNA SNHG3表達比較 胃癌細胞MGC-803中LncRNA SNHG3相對表達量為正常胃黏膜上皮細胞GES1的(1.992±0.099)倍，MGC-803細胞中LncRNA SNHG3相對表達量高于GES1細胞(P<0.01)。在人胃癌細胞MGC-803中，空白對照組、陰性對照組、SNHG3-siRNA 組LncRNA SNHG3 相對表達量分別為1.00±0.00、0.89±0.21、0.27±0.03。SNHG3-siRNA組LncRNA SNHG3 相對表達量低于空白對照組、陰性對照組(P均<0.05)。

2.2 三組細胞增殖能力比較 CCK-8法檢測結果顯示，SNHG3-siRNA組、陰性對照組、空白對照組OD450分別為0.410 9±0.001 5、0.494 4±0.001 2、0.511 2±0.001 1。siRNA組的細胞增殖能力均低于陰性對照組、空白對照組(P均<0.01)。

2.3 細胞克隆形成率比較 SNHG3-siRNA組、陰性對照組、空白對照組的克隆形成率分別為5.89%±0.44%、9.48%±1.17%、10.00%±0.76%。SNHG3-siRNA組克隆形成率低于陰性對照組、空白對照組(P均<0.01)。

2.4 細胞遷移和侵襲能力比較 在不預鋪基質膠Transwell小室實驗中，SNHG3-siRNA組、陰性對照組、空白對照組遷移到濾膜下表面的細胞數分別為(38.6±1.5)、(148.6±10.2)、(157.0±18.0)個/視野, SNHG3-siRNA組遷移細胞數低于陰性對照組、空白對照組(P均<0.01)。Transwell小室實驗中，SNHG3-siRNA組、陰性對照組、空白對照組的遷移到濾膜下表面的細胞數分別為(31.0±6.6)、(91.1±11.1)、(90.3±7.5)個/視野, SNHG3-siRNA組穿膜細胞數低于陰性對照組、空白對照組(P均<0.01)。

2.5 細胞周期和凋亡情況比較 MGC-803細胞轉染24 h后SNHG3 siRNA組G0/G1期細胞百分比上升至62.89%±5.25%，與陰性對照組相比差異無統計學意義(P>0.05), S期細胞比例無顯著變化；G2/M期細胞比例下降至7.15%±1.08%，與陰性對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)。下調LncRNA SNHG3表達后，MGC-803細胞凋亡率上升至10.73%±0.77%，與空白對照組(1.54%±0.57%)、陰性對照組(2.34%±0.84%)相比差異有統計學意義(P均<0.001)。見表1。

表1 三組各周期細胞占比比較

注：與siRNA組相比，*P<0.01。

2.6 STAT3、MMP-2、c-Myc和p-STAT3蛋白表達比較 Western blotting結果顯示，相較于陰性對照組和空白對照組，siRNA組的STAT3、MMP-2、c-Myc、p-STAT3蛋白表達下降(P<0.05)，p-STAT3/STAT3值降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組細胞STAT3、MMP-2、c-Myc和p-STAT3蛋白表達比較

注：與siRNA組相比，*P<0.05。

3 討論

在人類基因組序列中,僅有1.5%的核酸序列用于蛋白質編碼,而占據人類基因組98.5%的是非蛋白編碼序列。非編碼RNA是一大類不具有蛋白編碼潛能的RNA轉錄本[9]。目前研究表明，LncRNA在腫瘤的發生發展中起重要調控作用[10]。SNHG3作為一種LncRNA，最初由Pelczar等[11]發現。Huang等[12]報道，在結直腸癌中，SNHG3作為內源性競爭性RNA與miR-182-5p相互競爭，導致c-Myc過表達并作用于c-Myc的目的基因，從而促進結直腸癌進展。我們在前期實驗中證實了LncRNA SNHG3在胃腺癌組織中高表達[8]，張子龍等[13]亦報道，LncRNA SNHG3在胃癌中高表達，并且高表達的胃癌患者生存時間低于低表達者。本研究以胃癌細胞MGC-803為研究對象，qRT-PCR結果顯示，胃癌細胞MGC-803中LncRNA SNHG3的相對表達量高于正常胃黏膜上皮細胞系GES1，提示LncRNA SNHG3高表達與胃癌的發生相關。

應用siRNA技術轉染MGC-803細胞下調LncRNA SNHG3表達后，CCK-8實驗和平板克隆實驗提示細胞增殖能力、克隆形成能力均受到顯著抑制，提示LncRNA SNHG3在胃癌發展及克隆性增殖過程中發揮了一定作用。進一步研究發現，下調LncRNA SNHG3表達后，抑制胃癌細胞MGC-803進入G2/M期，并且凋亡比例顯著增加。LncRNA SNHG3下調所引起的分裂增殖抑制、凋亡增加可能是胃癌細胞增殖能力下降的部分原因。Transwell遷移、侵襲實驗表明，胃癌細胞MGC-803在LncRNA SNHG3下調后的遷移及侵襲能力減弱，說明在侵襲和轉移過程中LncRNA SNHG3可能扮演了重要角色。

STATs家族成員具有信號轉導和轉錄調控雙重功能[14]。STAT3是STAT家族中的重要一員，其與腫瘤的關系密切，過度表達與腫瘤的增殖、細胞凋亡抑制、侵襲和轉移、新血管生成等密切相關，被認為是一種原癌基因，有活性的p-STAT3進入細胞核內調控相關基因的轉錄[15]。Judd等[16]發現,抑制STAT3磷酸化可阻礙胃癌細胞增殖、減少炎癥和誘導凋亡。MMP-2是基質金屬蛋白酶MMPs家族中的重要一員，能降解細胞基底膜及細胞外基質成分Ⅳ型膠原，從而促進腫瘤侵襲和轉移。c-Myc是Myc家族成員之一，是與細胞增殖和凋亡密切相關的一種癌基因[17]。下調LncRNA SNHG3表達后，STAT3、MMP-2、c-Myc的表達下降。p-STAT3/STAT3降低，提示可能通過抑制STAT3的表達和STAT3磷酸化水平，從而抑制了MGC-803細胞增殖，誘導了凋亡；抑制MMP-2表達，可能與抑制MGC-803細胞的侵襲有關。抑制c-Myc的表達，進入G2/M期的MGC-803細胞減少，并且凋亡比例顯著增加。這在一定程度上解釋了下調LncRNA SNHG3后細胞增殖、克隆、Transwell侵襲實驗和細胞周期、凋亡實驗的結果，抑制LncRNA SNHG3基因有望應用于胃癌的靶向治療。

綜上所述，LncRNA SNHG3在胃癌細胞中高表達，同時其是胃癌細胞增殖、抗凋亡、侵襲及轉移的必要因素，對其進行干擾可有效破壞胃癌細胞的上述生物學行為；其機制可能通過下調STAT3、MMP-2、c-Myc、p-STAT3蛋白表達實現，LncRNA SNHG3有望成為胃癌治療過程中的潛在分子靶點。