下調(diào)LncRNA SNHG3表達(dá)對人胃癌細(xì)胞MGC-803增殖、侵襲、凋亡的影響及機(jī)制

谷建斌，張國欣，張玉斌，張景承，王雪平，薛菲

石家莊市第一醫(yī)院，石家莊050011

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后相對較差，嚴(yán)重威脅人類健康。2012年全球胃癌新發(fā)病例約50%的病例發(fā)生在亞洲東部，主要集中在中國[1]。2015年中國胃癌新發(fā)病例約為67.9萬例，胃癌死亡病例約為49.8萬例，是嚴(yán)重危害中國居民健康的主要疾病[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA) 指長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，近年來研究結(jié)果顯示，在腫瘤組織和正常組織中有一系列差異表達(dá)的LncRNA[3，4]，在多種腫瘤如胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮重要作用[5～7]。核仁小分子RNA宿主基因3(SNHG3)是一種LncRNA，位于染色體1p35.3。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，LncRNA SNHG3在胃腺癌組織中異常高表達(dá)[8]，提示其異常表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生和惡性進(jìn)展密切相關(guān)。2017年10月～2018年12月，本研究通過 siRNA 技術(shù)下調(diào)胃癌細(xì)胞MGC-803中LncRNA SNHG3表達(dá)，探討LncRNA SNHG3表達(dá)變化對胃癌細(xì)胞MGC-803增殖、侵襲和凋亡的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供；人胃癌細(xì)胞MGC-803購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。SNHG3-siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。LncRNA SNHG3、β-actin引物使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Roter gene 3000(澳大利亞Corbett公司)；NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)(美國NanoDrop公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；BD Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(全式金公司)；Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)；goat anti rabbit IgG(H+L)，HRP(美國Jackson)；ECL(美國Millipore公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌細(xì)胞MGC-803及正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES1均接種于RPMI 1640培養(yǎng)基，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后消化傳代。

1.3 LncRNA SNHG3表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。取對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞MGC-803及正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1，采用qRT-PCR試劑盒檢測LncRNA SNHG3表達(dá)。LncRNA SNHG3正向引物:5′-AGACAGATTCGCAGTGGTCG-3′，反向引物:5′-GTCTCCATGGCCCACTTCTG-3′。β-actin正向引物：5′-CACCCCAGCCATGTACGTTG-3′，反向引物：5′-AATGTCACGCACGATTTCCC-3′。采用定量2-△△CT法計(jì)算胃癌細(xì)胞LncRNA SNHG3相對表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞MGC-803,隨機(jī)分為SNHG3-siRNA 組、陰性對照組和空白對照組，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。各組常規(guī)培養(yǎng)24 h，SNHG3-siRNA 組加入LncRNA SNHG3 siRNA(正向引物:5′-GCAUUUAGCUAGGAAUGCATT-3′，反向引物:5′-UGCAUUCCUAGCUAAAUGCTT-3′)轉(zhuǎn)染，陰性對照組加入無關(guān)序列 NC siRNA(正向引物:5′-ACUGCGACUGCUUCACUUGTT-3′，反向引物:5′-CAAGUGAAGCAGUCGCAGUTT-3′)轉(zhuǎn)染，空白對照組不予轉(zhuǎn)染。所有操作嚴(yán)格按 Lipofectamine2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h，提取細(xì)胞總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。根據(jù) SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明配制反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s共40個(gè)循環(huán)。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染24 h的三組細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，以5×103個(gè)/孔種植于96孔板(100 μL/孔)，在培養(yǎng)24 h 時(shí)每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在450 nm波長下，用酶標(biāo)儀測定各孔光密度(OD)值。

1.6 克隆形成率測算 采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于6孔板(300個(gè)/孔)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周，觀察克隆細(xì)胞形成至合適大小時(shí)用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，加入適量0.1%結(jié)晶紫染色液染色10 min，倒置顯微鏡下觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?%)=克隆數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 細(xì)胞遷移能力檢測 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞，均計(jì)數(shù)5×104個(gè)細(xì)胞加入Transwell小室上室中，用無血清培養(yǎng)液正常培養(yǎng)，小室下加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h，將小室取出用PBS沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色液染色20 min。顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.8 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。Transwell小室上室用50 μL Matrigel膠包被，在37 ℃中放置3～5 h。各組分別取200 μL(密度為2.5×105個(gè)/mL)細(xì)胞接種于Transwell小室上室，在下室加入DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后擦去上室的Matrigel膠和多余細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色液染色，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.9 細(xì)胞周期及凋亡檢測 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析，通過標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶消化程序收獲生長對數(shù)期的轉(zhuǎn)染和對照細(xì)胞，用 PBS 洗滌，加入PI染液500 μL和破膜劑5 μL，室溫避光孵育30 min，收集培養(yǎng)物并使用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。統(tǒng)計(jì)G0/G1、S和G2/M期細(xì)胞的百分比。按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明，將細(xì)胞每管加入Annexin V-FITC 5 μL和10 μL 20 μg/mL PI溶液，室溫避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀測定并獲取細(xì)胞凋亡比例。

1.10 信號傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、c-Myc和p-STAT3蛋白表達(dá)檢測 應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法測定。使用 RIPA 緩沖液提取總細(xì)胞裂解物，通過配置12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，恒壓80 V，2 h)分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉，并在4 ℃下與一抗孵育過夜。緩沖液洗膜(15 min×3次)，將膜與二抗孵育，最后用 ECL底物試劑盒檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Bio-Rad Image Lab 5.2.1軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 人胃癌細(xì)胞MGC-803中各組LncRNA SNHG3表達(dá)比較 胃癌細(xì)胞MGC-803中LncRNA SNHG3相對表達(dá)量為正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1的(1.992±0.099)倍，MGC-803細(xì)胞中LncRNA SNHG3相對表達(dá)量高于GES1細(xì)胞(P<0.01)。在人胃癌細(xì)胞MGC-803中，空白對照組、陰性對照組、SNHG3-siRNA 組LncRNA SNHG3 相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.89±0.21、0.27±0.03。SNHG3-siRNA組LncRNA SNHG3 相對表達(dá)量低于空白對照組、陰性對照組(P均<0.05)。

2.2 三組細(xì)胞增殖能力比較 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，SNHG3-siRNA組、陰性對照組、空白對照組OD450分別為0.410 9±0.001 5、0.494 4±0.001 2、0.511 2±0.001 1。siRNA組的細(xì)胞增殖能力均低于陰性對照組、空白對照組(P均<0.01)。

2.3 細(xì)胞克隆形成率比較 SNHG3-siRNA組、陰性對照組、空白對照組的克隆形成率分別為5.89%±0.44%、9.48%±1.17%、10.00%±0.76%。SNHG3-siRNA組克隆形成率低于陰性對照組、空白對照組(P均<0.01)。

2.4 細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 在不預(yù)鋪基質(zhì)膠Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，SNHG3-siRNA組、陰性對照組、空白對照組遷移到濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)分別為(38.6±1.5)、(148.6±10.2)、(157.0±18.0)個(gè)/視野, SNHG3-siRNA組遷移細(xì)胞數(shù)低于陰性對照組、空白對照組(P均<0.01)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，SNHG3-siRNA組、陰性對照組、空白對照組的遷移到濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)分別為(31.0±6.6)、(91.1±11.1)、(90.3±7.5)個(gè)/視野, SNHG3-siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)低于陰性對照組、空白對照組(P均<0.01)。

2.5 細(xì)胞周期和凋亡情況比較 MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后SNHG3 siRNA組G0/G1期細(xì)胞百分比上升至62.89%±5.25%，與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), S期細(xì)胞比例無顯著變化；G2/M期細(xì)胞比例下降至7.15%±1.08%，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。下調(diào)LncRNA SNHG3表達(dá)后，MGC-803細(xì)胞凋亡率上升至10.73%±0.77%，與空白對照組(1.54%±0.57%)、陰性對照組(2.34%±0.84%)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。見表1。

表1 三組各周期細(xì)胞占比比較

注：與siRNA組相比，*P<0.01。

2.6 STAT3、MMP-2、c-Myc和p-STAT3蛋白表達(dá)比較 Western blotting結(jié)果顯示，相較于陰性對照組和空白對照組，siRNA組的STAT3、MMP-2、c-Myc、p-STAT3蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，p-STAT3/STAT3值降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組細(xì)胞STAT3、MMP-2、c-Myc和p-STAT3蛋白表達(dá)比較

注：與siRNA組相比，*P<0.05。

3 討論

在人類基因組序列中,僅有1.5%的核酸序列用于蛋白質(zhì)編碼,而占據(jù)人類基因組98.5%的是非蛋白編碼序列。非編碼RNA是一大類不具有蛋白編碼潛能的RNA轉(zhuǎn)錄本[9]。目前研究表明，LncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用[10]。SNHG3作為一種LncRNA，最初由Pelczar等[11]發(fā)現(xiàn)。Huang等[12]報(bào)道，在結(jié)直腸癌中，SNHG3作為內(nèi)源性競爭性RNA與miR-182-5p相互競爭，導(dǎo)致c-Myc過表達(dá)并作用于c-Myc的目的基因，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展。我們在前期實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了LncRNA SNHG3在胃腺癌組織中高表達(dá)[8]，張子龍等[13]亦報(bào)道，LncRNA SNHG3在胃癌中高表達(dá)，并且高表達(dá)的胃癌患者生存時(shí)間低于低表達(dá)者。本研究以胃癌細(xì)胞MGC-803為研究對象，qRT-PCR結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞MGC-803中LncRNA SNHG3的相對表達(dá)量高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES1，提示LncRNA SNHG3高表達(dá)與胃癌的發(fā)生相關(guān)。

應(yīng)用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞下調(diào)LncRNA SNHG3表達(dá)后，CCK-8實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)提示細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力均受到顯著抑制，提示LncRNA SNHG3在胃癌發(fā)展及克隆性增殖過程中發(fā)揮了一定作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LncRNA SNHG3表達(dá)后，抑制胃癌細(xì)胞MGC-803進(jìn)入G2/M期，并且凋亡比例顯著增加。LncRNA SNHG3下調(diào)所引起的分裂增殖抑制、凋亡增加可能是胃癌細(xì)胞增殖能力下降的部分原因。Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)表明，胃癌細(xì)胞MGC-803在LncRNA SNHG3下調(diào)后的遷移及侵襲能力減弱，說明在侵襲和轉(zhuǎn)移過程中LncRNA SNHG3可能扮演了重要角色。

STATs家族成員具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能[14]。STAT3是STAT家族中的重要一員，其與腫瘤的關(guān)系密切，過度表達(dá)與腫瘤的增殖、細(xì)胞凋亡抑制、侵襲和轉(zhuǎn)移、新血管生成等密切相關(guān)，被認(rèn)為是一種原癌基因，有活性的p-STAT3進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[15]。Judd等[16]發(fā)現(xiàn),抑制STAT3磷酸化可阻礙胃癌細(xì)胞增殖、減少炎癥和誘導(dǎo)凋亡。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs家族中的重要一員，能降解細(xì)胞基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅳ型膠原，從而促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。c-Myc是Myc家族成員之一，是與細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)的一種癌基因[17]。下調(diào)LncRNA SNHG3表達(dá)后，STAT3、MMP-2、c-Myc的表達(dá)下降。p-STAT3/STAT3降低，提示可能通過抑制STAT3的表達(dá)和STAT3磷酸化水平，從而抑制了MGC-803細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)了凋亡；抑制MMP-2表達(dá)，可能與抑制MGC-803細(xì)胞的侵襲有關(guān)。抑制c-Myc的表達(dá)，進(jìn)入G2/M期的MGC-803細(xì)胞減少，并且凋亡比例顯著增加。這在一定程度上解釋了下調(diào)LncRNA SNHG3后細(xì)胞增殖、克隆、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期、凋亡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，抑制LncRNA SNHG3基因有望應(yīng)用于胃癌的靶向治療。

綜上所述，LncRNA SNHG3在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，同時(shí)其是胃癌細(xì)胞增殖、抗凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移的必要因素，對其進(jìn)行干擾可有效破壞胃癌細(xì)胞的上述生物學(xué)行為；其機(jī)制可能通過下調(diào)STAT3、MMP-2、c-Myc、p-STAT3蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)，LncRNA SNHG3有望成為胃癌治療過程中的潛在分子靶點(diǎn)。