miR-130a靶向調(diào)控FOSL1基因?qū)σ认侔㏄ANC-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制

曾凱，何磊，葛萍萍，范東，許利劍

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南京210003

胰腺癌是消化系統(tǒng)腫瘤，惡性程度極高，是全世界癌癥相關(guān)死亡的第四大主要原因，2018年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界約有45.8萬(wàn)例胰腺癌新發(fā)病例以及約43.2萬(wàn)例與胰腺癌相關(guān)的死亡病例，且胰腺癌的發(fā)病率和病死率最近顯示出持續(xù)增加的趨勢(shì)[1]。雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，胰腺癌的治療手段在不斷提升，但患者的預(yù)后仍較差，總體5年相對(duì)存活率僅約5%[2]，因此迫切需探索新的治療手段提高胰腺癌患者生存率，而胰腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，在分子水平研究胰腺癌的進(jìn)展機(jī)制是尋找治療靶點(diǎn)的重要途徑。微小RNA( miR-130a) 密切參與正常和惡性組織的各種生理過程，在腫瘤疾病中miR-130a顯示出雙重作用，即表達(dá)升高發(fā)揮促癌作用和表達(dá)降低發(fā)揮抑癌作用，具有成為抗腫瘤治療靶點(diǎn)的潛力[3～6]。但miR-130a在胰腺癌中的表達(dá)及作用未知，研究報(bào)道，miR-130a在胰腺癌癌前病變高風(fēng)險(xiǎn)的胰腺癌導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤(IPMNs)中表達(dá)下調(diào)，推測(cè)miR-130a在胰腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用[7]。2018年6月～2019年8月，我們探討了miR-130a通過靶向調(diào)控FOS樣抗原1(FOSL1)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 胰腺癌細(xì)胞PANC-1 (中國(guó)科學(xué)院，上海)；RPMI1640培養(yǎng)基、FBS、青鏈霉素(Giboc，美國(guó))；DP501 miRcute miRNA 提取試劑盒(天根，中國(guó)北京)；TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (ABI，美國(guó))；RT-PCR試劑盒(TaKaRa，日本)；miR-130a、FOSL1、內(nèi)參U6和GAPDH引物(Invitrogen，美國(guó))；miR-130a mimic、過表達(dá)FOSL1質(zhì)粒、pGLO-FOSL1-(野生型)和pGLO-FOSL1-mut (突變型) (吉?jiǎng)P，中國(guó)上海)；CCK8試劑(GlpBio，美國(guó))；流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物，中國(guó)南京)；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒 (碧云天，中國(guó)上海)；蛋白裂解液(索萊寶，中國(guó)北京)；FOSL1和p53抗體(Abcam，英國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 胰腺癌細(xì)胞PANC-1快速?gòu)?fù)蘇后重懸至含有10%FBS、0.1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)，胰酶消化后傳代，以20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞鋪至6孔板中，分為NC組和miR-130a mimic組，細(xì)胞貼壁12 h時(shí)采用脂質(zhì)體2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，NC組轉(zhuǎn)染對(duì)照，miR-130a mimic組轉(zhuǎn)染miR-130a模擬物，用于后續(xù)miR-130a的功能研究。同時(shí)分為NC組、miR-130a mimic組和miR-130a mimic+oe-FOSL1(過表達(dá)FOSL1質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞貼壁12 h時(shí)采用脂質(zhì)體2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，NC組轉(zhuǎn)染對(duì)照，miR-130a mimic組轉(zhuǎn)染miR-130a模擬物，miR-130a mimic+oe-FOSL1組轉(zhuǎn)染miR-130a模擬物和FOSL1過表達(dá)質(zhì)粒。用于后續(xù)miR-130a 靶向FOSL1的功能研究。

1.3 miR-130a和FOSL1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。收集NC組、miR-130a mimic組和miR-130a mimic+oe-FOSL1組胰腺癌PANC-1細(xì)胞，采用DP501 miRcute miRNA提取試劑盒獲得細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度后，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系，并以95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s、65 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增，檢測(cè)各樣品的循環(huán)閾值(Ct)，以2-ΔΔCt公式計(jì)算miR-130a相對(duì)表達(dá)量(U6為內(nèi)參)和FOSL1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(GAPDH為內(nèi)參)。miR-130a正向引物:5′-TTGCGATTCTGTTTTGTGCT-3′,反向引物:5′-GTGGGGTCCTCAGTGGG-3′。U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。FOSL1正向引物:5′-CAGGCGGAGACTGACAAACTG-3′,反向引物:5′-TCCTTCCGGGATTTTGCAGAT-3′。GAPDH正向引物:5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′,反向引物:5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。將2 000個(gè)胰腺癌細(xì)胞PANC-1接種至96孔板中，按上述1.2分組的方法進(jìn)行各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染的第0、24、48和72 h時(shí)每孔加入10 μL CCK-8試劑，放置培養(yǎng)箱中1 h后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處OD值。

1.5 細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞及上清液，離心PBS洗3次后，重懸至500 μL的染色緩沖液中,分別加入5 μL的Annexin V-FITC和PI染色進(jìn)行染色，5 min后采用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.6 熒光素酶活性檢測(cè) 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-130a 的FOSL1靶向調(diào)控關(guān)系。TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-130a的靶基因。將3 000個(gè)胰腺癌細(xì)胞PANC-1接種到96孔板中，分為FOSL1-wt+NC組、FOSL1-wt+miR-130a mimic組、FOSL1-mut+NC組和FOSL1-mut+miR-130a mimic組，細(xì)胞貼壁12 h，采用脂質(zhì)體2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，F(xiàn)OSL1-wt+NC組轉(zhuǎn)染FOSL1野生型質(zhì)粒和對(duì)照，F(xiàn)OSL1-wt+miR-130a mimic組轉(zhuǎn)染FOSL1野生型質(zhì)粒和miR-130a模擬物，F(xiàn)OSL1-mut+NC組轉(zhuǎn)染FOSL1突變型質(zhì)粒和對(duì)照，F(xiàn)OSL1-mut+miR-130a mimic組轉(zhuǎn)染FOSL1突變型質(zhì)粒和miR-130a模擬物。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.7 FOSL1、p53蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞斑塊，加入蛋白裂解液吹打，完全裂解后在低溫條件下超高速離心，檢測(cè)蛋白濃度后，煮沸變性，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/GAPDH灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 NC組、miR-130a mimic組miR-130a表達(dá)比較 miR-130a在NC組、miR-130a mimic組PANC-1細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、8.24±0.89，與NC組相比，miR-130a mimic組細(xì)胞中miR-130a表達(dá)增加(t=14.091,P<0.05)。

2.2 NC組、miR-130a mimic組細(xì)胞增殖能力比較 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-130a mimic組細(xì)胞增殖能力降低，且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，兩組間的增殖差異越明顯(P<0.05)。見表1。

2.3 NC組、miR-130a mimic組細(xì)胞凋亡率比較 NC組、miR-130a mimic組早期凋亡率分別為1.35%±0.04%、7.98%±0.35%，晚期凋亡率分別為3.54%±0.28%、4.05%±0.21%，與NC組相比，miR-130a mimic組細(xì)胞早期凋亡率增加(t=32.598,P<0.001)，晚期凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.524,P=0.053)。

表1 NC組和miR-130a mimic組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖活力比較(OD值,

注：與NC組相比，*P<0.05。

2.4 miR-130a對(duì)FOSL1的靶向調(diào)控作用 TargetScan7.1軟件在線預(yù)測(cè)顯示，miR-130a與FOSL1啟動(dòng)子區(qū)具有結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)OSL1-wt+NC組、FOSL1-wt+ miR-130a組、FOSL1-mut+NC組、FOSL1-mut+miR-130a組的熒光素酶活性分別為1.00±0.09、0.39±0.08、1.00±0.02、0.93±0.12，與FOSL1-wt+NC組相比，F(xiàn)OSL1-wt+ miR-130a組的熒光素酶活性降低(P<0.05)，而FOSL1-mut+NC和FOSL1-mut+miR-130a組間的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NC組(1.00±0.00)相比，miR-130a mimic組FOSL1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.23±0.08)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 miR-130a與FOSL1的結(jié)合位點(diǎn)

2.5 miR-130a靶向FOSL1對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖能力的影響 見表2。

表2 NC組、miR-130a mimic組和miR-130a mimic+oe-FOSL1組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖活力比較(OD值,

注：與NC組相比，*P<0.05；與miR-130a mimic組相比，#P<0.05。

2.6 miR-130a靶向FOSL1對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡能力的影響 流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，NC組、miR-130a mimic組和miR-130a mimic+oe-FOSL1組早期凋亡率分別為1.06%±0.08%、9.04%±0.42%、7.98%±0.35%，晚期凋亡率分別為4.65%±0.19%、5.84%±0.14%、5.01%±0.34%，與NC組相比，miR-130a mimic組和miR-130a mimic+oe-FOSL1組細(xì)胞早期凋亡率升高(t分別為32.328、33.384,P均<0.05)。而與miR-130a mimic 組相比，miR-130a mimic+oe-FOSL1組細(xì)胞凋亡率降低(t=3.358,P=0.020)。

2.7 miR-130a調(diào)控FOSL1對(duì)p53蛋白表達(dá)的影響 NC組、miR-130a mimic組和miR-130a mimic+oe-FOSL1組FOSL1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.12±0.07、0.23±0.04、0.85±0.07，p53蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.19±0.10、1.84±0.18、0.95±0.09，與NC組相比，miR-130a mimic組和miR-130a mimic+oe-FOSL1組細(xì)胞中FOSL1蛋白表達(dá)降低(t分別為19.120、4.724，P均<0.05)、p53蛋白表達(dá)增加(t分別為13.879、9.784,P均<0.05)。而與miR-130a mimic組相比，miR-130a mimic+oe-FOSL1組細(xì)胞中FOSL1蛋白表達(dá)增加(t=13.320,P<0.001)、p53蛋白表達(dá)降低(t=7.661,P=0.001)。見圖2。

圖2 miR-130a靶向調(diào)控FOSL1促進(jìn)p53蛋白表達(dá)

3 討論

胰腺癌屬于高度惡性腫瘤之一，被稱為“癌中之王”，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。胰腺癌的治療包括根治性手術(shù)切除、化學(xué)治療、放射治療等腫瘤傳統(tǒng)治療手段[8，9]，但由于胰腺癌起病具有隱匿性，早期診斷率極低，多數(shù)患者失去了根治性手術(shù)切除機(jī)會(huì)，且胰腺癌具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的特點(diǎn)，使得疾病進(jìn)展迅速，對(duì)化學(xué)療法和放射療法的抵抗力強(qiáng)，研究數(shù)據(jù)顯示,60%的PC患者在診斷時(shí)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，只有10%～15%的患者有手術(shù)機(jī)會(huì)，這導(dǎo)致在過去幾十年胰腺癌患者的存活率未見明顯升高[2]。臨床實(shí)踐中新型分子靶向藥物在抗腫瘤治療中取得了顯著療效，近年來(lái)分子靶向藥物包括血管生成通路、表皮生長(zhǎng)因子受體通路和KRAS通路等相關(guān)抑制劑亦在胰腺癌的治療中取得一定進(jìn)展[10]，但目前的治療未達(dá)到理想的效果，因此，迫切需探索治療胰腺癌的新靶點(diǎn)。

miRNA是長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，是諸多生物學(xué)過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，如細(xì)胞增殖和分化、代謝和細(xì)胞活化，大量miRNA已被證明在包括胰腺癌的幾乎所有腫瘤中表達(dá)異常，并且密切參與腫瘤的惡性進(jìn)展[11]。越來(lái)越多的研究已證實(shí),miR-130a是與腫瘤發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)的miRNA之一，在直腸癌和宮頸癌等腫瘤中表達(dá)增加，促進(jìn)放射敏感抗性、增殖和侵襲等腫瘤惡性行為[3，4]，在肝細(xì)胞肝癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞等惡性腫瘤中表達(dá)減少，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[5，6]。Permuth-Wey等[7]報(bào)道與低風(fēng)險(xiǎn)IPMNs相比，高風(fēng)險(xiǎn)IPMNs全基因組miRNA表達(dá)譜分析顯示，miR-130a和miR-100等6個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，并且其致癌靶標(biāo)表達(dá)上調(diào)，高風(fēng)險(xiǎn)IPMNs是胰腺癌的前體，提示miR-130a可能在胰腺癌中發(fā)揮重要作用，因此本研究在細(xì)胞水平研究了miR-130在胰腺癌中發(fā)揮的生物學(xué)功能。凋亡和增殖是調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)控制途徑的兩種主要機(jī)制，是腫瘤細(xì)胞的兩大重要表型，被認(rèn)為是抗腫瘤治療的靶向策略[12]。本研究應(yīng)用miR-130a mimic轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞PANC-1，并成功過表達(dá)胰腺癌細(xì)胞中miR-130a后，CCK8和凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-130a后，胰腺癌細(xì)胞的增殖能力降低、細(xì)胞凋亡增多。與Ye等[13]報(bào)道m(xù)iR-130a在非小細(xì)胞肺癌中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果一致，表明miR-130a在胰腺癌中發(fā)揮抑癌因子的作用。

miRNA雖然不具備編碼蛋白質(zhì)功能，但其可通過誘導(dǎo)其靶mRNA的切割或阻止其翻譯成蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)發(fā)揮其調(diào)控作用[11]。因此我們進(jìn)一步探索了miR-130a在胰腺癌中發(fā)揮作用的靶基因，TargetScan7.1軟件預(yù)測(cè)提示,FOSL1基因是miR-130a的靶基因，F(xiàn)OSL1在骨肉瘤和前列腺癌等腫瘤中被報(bào)道為腫瘤促癌基因[14,15]，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OSL1高表達(dá)預(yù)示突變型KRAS肺癌和胰腺癌患者存活率較差[16]。并且新型多激酶抑制劑LY-1816通過下調(diào)FOSL1的表達(dá)抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。miR-130a的過表達(dá)通過靶向抑制FOSL1的水平降低浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[18]。因此miR-130a可能通過靶向負(fù)調(diào)控癌基因FOSL1抑制胰腺癌的進(jìn)展。本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)證實(shí)FOSL1為miR-130a的靶基因，qRT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)OSL1 mRNA在過表達(dá)miR-130a的胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)降低，表明miR-130a在胰腺癌細(xì)胞中負(fù)靶向調(diào)控FOSL1的表達(dá)，與在乳腺癌中的研究相似[18]。但miR-130a是否通過負(fù)調(diào)控FOSL1抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡有待探討。本研究采用過表達(dá)FOSL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染miR-130a mimic胰腺癌細(xì)胞，研究FOSL1對(duì)miR-130a生物學(xué)功能的影響，結(jié)果顯示過表達(dá)FOSL1可減弱miR-130a對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC-1的增殖抑制作用和凋亡的促進(jìn)作用。表明miR-130a通過FOSL1發(fā)揮生物學(xué)功能。p53屬于經(jīng)典的抑癌基因，具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要生物學(xué)功能[19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞中p53的表達(dá)，而過表達(dá)miR-130a可減弱miR-130a對(duì)p53蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，因此miR-130a靶向FOSL1可能通過促進(jìn)抑癌基因p53的表達(dá)抑制胰腺癌的惡性進(jìn)程。

綜上所述，miR-130a通過靶向抑制FOSL1降低胰腺癌細(xì)胞的增殖能力和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡發(fā)生，進(jìn)一步的作用機(jī)制可能通過促進(jìn)p53的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)功能。miR-130a可能是治療胰腺癌的潛在分子靶點(diǎn)。