食管癌組織中miR-1269a、SOX6的表達變化及意義

黃偉釗，吳穎猛，胡榮貴，葉紅雨，傅劍華

1中山大學腫瘤防治中心·華南腫瘤學國家重點實驗室廣東食管癌研究所，廣州510089；2 中山市人民醫院

基金項目：廣東省自然科學基金資助項目(2016A030310409)。

第一作者簡介：黃偉釗(1978-)，男，副主任醫師，博士，主要研究方向為食管癌的綜合治療。E-mail： zhijiaoyy@163.com

通信作者簡介：傅劍華(1965-)，男，主任醫師，博士，主要研究方向為食管癌的綜合治療。E-mail： jiahu0101@126.com

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，是世界上第八大最常見癌癥和第六大最常見的癌癥死亡原因[1]。食管癌主要分為兩型：食管鱗狀細胞癌(ESCC)與食管腺癌(EAC)，我國主要以前者為主。微小RNA(miRNA)是長度為20～22個核苷酸的非編碼RNA亞型，與多種腫瘤的發生發展有關，如非小細胞肺癌[2]。通常情況下，miRNA可與靶基因的3′-UTR結合，從而促進癌細胞的增殖、遷移[3]。如miR-216a可通過抑制TLR48來抑制腎癌細胞的生長。miR-1269家族包括miR-1269a和miR-1269b兩個成員，miR-1269a是在大腸癌中首次被發現的一種癌基因miRNA，其基因位于染色體4q13.2。miR-1269a可通過與轉化生長因子-β12(TGF-β12)間的反饋環促進癌癥的發展和轉移[4]。在肝癌中，miR-1269a可靶向調節LRP6和SPATS2L13的表達來影響其發展[5]。SOX6屬于性別決定區Y框相關轉錄因子D亞家族的一員,染色體位置為11號染色體短臂15.2～15.3區域，具有多種生物學功能，如促進軟骨形成、神經發育及骨髓造血等[6]。SOX6基因編碼的蛋白可通過高遷移率族蛋白與DNA結合，在細胞分化、增殖及凋亡中發揮關鍵作用[7]。在食管癌的相關研究中發現，SOX6基因是miR-1269a的靶基因，miR-1269a可抑制SOX6蛋白表達，促進腫瘤的發生發展。但兩者在食管癌中的具體作用機制尚不清楚，有待進一步研究。2013年1月～2019年6月，我們檢測了食管癌組織中miR-1269a和SOX6的表達，并探究二者在食管癌發生發展中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2019年6月于中山市人民醫院住院治療的食管癌患者120例，納入標準：①經病理活檢或術后病理檢查明確診斷；②均為首次診斷食管癌，既往未接受過抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整，且均簽署知情同意書。排除標準：①患有其他消化系統疾病，如反流性食管炎、胃潰瘍等；②患有其他系統疾病或惡性腫瘤，如胃癌、肺癌等；③患有免疫功能缺陷疾病。120例患者中，男109例、女11例，年齡30～70(55.3±3.7歲)，其中≥55歲者52例，<55歲者68例；組織病理檢查結果顯示，中低分化55例，高分化65例；腫瘤TNM分期(參照文獻[8]標準)：Ⅰ期51例，Ⅱ期33例，Ⅲ期20例，Ⅳ期16例；有淋巴結轉移52例；腫瘤浸潤深度T1：42例，T2：29例，T3：28例，T4：21例。

1.2 食管癌及癌旁正常組織中miR-1269a和SOX6表達檢測 收集術中獲取的新鮮癌組織和癌旁正常組織(距離癌組織>5 mm)，保存在液氮中，立即轉運至實驗室，置于-80 ℃冰箱中保存。取50 mg標本，應用TRIzol法提取總RNA(試劑盒購自美國Invitrogen公司)，使用微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA濃度，將符合標準的RNA凍存，備用。使用TaqMan miRNA反轉錄試劑盒(購自美國Invitrogen公司)將RNA反轉錄合成cDNA，反應條件：42 ℃ 60 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。U6作為內參基因。反應條件：65 ℃ 5 min ，16 ℃ 30 min，72 ℃ 15 min。實驗步驟嚴格按照反轉錄試劑盒說明書進行。miR-1269a正向引物：5′-CGTTGGAT-GAAGTCTCATGATAGGCCATC-3′，反向引物:5′-ATTGCGTGTCGT-GGAGTCGGCAATGC-3′；SOX6 正向引物：5′-GCTGGAGGAGATGACTC-GGAC-3′，反向引物:5′-GTTCGGTCCACTATTGATGGGG-3′；內參基因U6正向引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物:5′-GGCTGAGAACTGAATTCCA-3′；以GAPDH作為內參照，正向引物:5′-CGGATTTGGT-CGTATTGGG-3′，反向引物:5′-TGCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′。反應體系：cDNA 1.0 μL，正反向引物各1.0 μL，TaqDNA聚合酶0.125 μL，1 μL 20×SYBR Green及1 μL dNTPs，用去離子水補足體系至20 μL。PCR擴增反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環40 次，72 ℃延伸5 min。每個樣本至少重復3次。用FastStart Essential DNA Green Master(美國羅氏制藥國際集團公司)檢測miR-1269a和SOX6的相對表達量，以2-ΔΔCt法計算miR-1269a和SOX6的相對表達量。

2 結果

2.1 食管癌組織與癌旁組織中miR-1269a、SOX6 mRNA表達比較 食管癌組織與癌旁正常組織中miR-1269a的相對表達量分別為1.243±0.213、0.816±0.098，癌組織中miR-1269a的相對表達量高于癌旁正常組織(t=19.950，P=0.000)；食管癌組織與癌旁正常組織中SOX6 mRNA相對表達量分別為0.761±0.082、1.027±0.162，癌組織中SOX6 mRNA相對表達量低于癌旁正常組織(t=16.048，P=0.000)。

2.2 食管癌組織中miR-1269a、SOX6表達與患者臨床病理特征間的關系 食管癌組織中miR-1269a、SOX6表達與腫瘤TNM分期、組織分化程度及腫瘤浸潤深度有關(P均<0.05)，與患者年齡、性別及淋巴結轉移無關(P均>0.05)。見表1。

2.3 食管癌組織中miR-1269a與SOX6表達的相關性 Pearson相關分析顯示，食管癌組織中miR-1269a與SOX6表達呈負相關(r=-0.716，P=0.000)。

3 討論

食管癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一。雖然近年來其發病率有所下降，但由于食管癌早期癥狀不明顯，因此部分患者就診時已進入晚期。食物過燙、經常進食刺激性食物是罹患食管癌的危險因素，還可能與環境因素和家族遺傳史有關。食管癌的治療方式包括手術、化療、放療或兩者結合等方式，但癌癥患者的治愈率低，預后差，食管癌患者的術后5年生存率為14%～22%[9]。

表1 食管癌組織中miR-1269a、SOX6表達與患者臨床病理特征間的關系

miR-1269a是近年發現的與腫瘤轉移相關的miRNAs，在多種腫瘤細胞中均呈高表達狀態，如肝癌、胃癌。有文獻報道，miR-1269a參與癌細胞的增殖、分化及轉移，使得腫瘤惡性程度升高，進一步影響其治療效果[5]，如miR-1269a可促進結腸癌及膽管癌細胞的增殖、分化及侵襲過程。miR-1269a通過調節靶基因(如MYCBP2、ZNF70、SPATS2L和LRP6)的表達，進而發揮其生物學功能[10，11]。因此，我們推測miR-1269a在食管癌的發生發展中亦發揮一定作用。本研究結果顯示，食管癌組織中miR-1269a相對表達量高于癌旁正常組織。提示miR-1269a可能參與了食管癌的癌變進展，其機制可能為高表達的miR-1269a上調靶基因(如MYCBP2)表達，促進細胞增殖，并且加速了細胞從G0向G1期的轉變過程，從而加快了癌細胞的增殖和分化，使得腫瘤細胞數量持續升高。本研究結果還顯示，miR-1269a表達與腫瘤TNM分期、組織分化程度及腫瘤浸潤深度有關。研究表明[4]，抑制miR-1269a表達可抑制細胞生長，降低細胞分化的速度。同時miR-1269a可上調Cyclin D1表達，抑制Rb的磷酸化，抑制腫瘤細胞的分化功能，使得腫瘤分化程度降低，TNM分期升高，腫瘤惡性程度進一步升高[12]。亦有研究發現，miR-1269a可上調TGF-β表達，而TGF-β誘導上皮間質轉化，或通過PI3K誘導Akt激活腫瘤細胞的侵襲和浸潤[13]。

SOX6是具有多種功能的轉化因子，在腫瘤的發生發展中發揮重要作用，如SOX6可抑制上皮間質轉化、抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲等[14]。SOX6在腎透明細胞癌、膀胱癌及骨肉瘤中均呈低表達狀態，并與腫瘤的預后相關。有研究表明，SOX6在食管癌中呈低表達狀態，其通過上調p53和p21同時下調Cyclin D1/CDK4、Cyclin A和β-catenin的表達，從而抑制食管癌的進展[15]。而SOX家族的其他成員，如SOX2、SOX4和SOX9，已在多種腫瘤疾病中被認定為腫瘤抑制因子[16]。本研究結果顯示，食管癌組織中SOX6相對表達量低于癌旁正常組織，機制可能為SOX6是miR-1269a的靶基因，miR-1269a表達上調時導致SOX6表達下降[17]。本研究結果還顯示，食管癌組織中SOX6的相對表達量與腫瘤TNM分期、組織分化程度和腫瘤浸潤深度有關。其原因可能為SOX6通過抑制胰腺β細胞中的Cyclin D1或激活紅細胞中SOCS3的轉錄來抑制腫瘤細胞的分化，使得腫瘤惡性程度增加，臨床分期升高[18]，并且SOX6發揮其抑癌基因的作用[19]，抑制腫瘤細胞的增殖，停滯了腫瘤細胞的生長周期，因此，當食管癌中SOX6表達下調時，會使腫瘤細胞的分化程度降低，腫瘤細胞的浸潤深度增加，進一步增加了腫瘤的惡性程度。

本研究結果還顯示，SOX6與miR-1269a表達呈負相關。SOX6是miR-1269a下游的靶基因，miR-1269a是SOX6重要的調控者[20]，且miR-1269a抑制SOX6的表達。因此，在食管癌中二者存在相輔相成、相互制約的作用，在疾病的發生發展過程中共同發揮重要作用。

綜上所述，食管癌組織中miR-1269a表達上調，SOX6表達下調，與腫瘤TNM分期、組織分化程度及腫瘤浸潤深度有關；二者聯合檢測有助于食管癌病情判斷。