胃癌組織中LETM1、HIF-1α的表達變化及意義

劉偉昌,馬秀麗,劉虎,王洪濤

武威市人民醫院,甘肅武威 733000

胃癌是常見的惡性腫瘤，其病死率在惡性腫瘤中居第二位[1]。早期胃癌臨床癥狀不明顯，晚期則出現胃區隱痛、幽門梗阻等癥狀，此時胃癌手術成功率較低，患者病死率較高。亮氨酸拉鏈EFhand結構域跨膜蛋白1(LETM1)是一種線粒體內膜蛋白，在多種腫瘤細胞中均呈高表達，如乳腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌等[2]，該蛋白在促進線粒體翻譯、調節鈣離子及鉀離子的運輸中有重要意義[3]。文獻[4]報道，LETM1還可抑制線粒體的合成功能來誘導宮頸癌Hela細胞的壞死。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是在人或動物體內缺氧時產生的因子，是缺氧誘導因子-1(HIF-1)的一個亞基，是體內氧平衡重要調節因子之一，在介導腫瘤細胞適應微缺氧的環境時發揮重要作用，其在多種腫瘤細胞中均呈陽性表達，如結腸癌、乳腺癌、宮頸癌及胰腺癌等[5]。研究證實，LETM1和HIF-1α在前列腺癌、結腸癌、肺癌中均呈高表達狀態，在腫瘤發生發展過程中起到一定促進作用，但兩者在胃癌中的作用機制及相關性研究較少。2013年1月～2019年5月，我們應用免疫組化技術檢測了胃癌組織及癌旁正常組織中LETM1和HIF-1α的表達，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2014年5月于我院住院治療的胃癌患者95例，納入標準：①符合2012版食管癌和胃癌治療指南中胃癌的診斷標準[6]，均經術后病理檢查確診為胃癌；②均為首次診斷，從未做過放療或化療；③患者臨床病理資料完整并接受隨訪，且均通過患者及家屬的同意并簽署知情同意書。排除標準：①患有其他消化系統疾病，如胃炎、胃潰瘍等；②患有其他系統疾病或惡性腫瘤，如食管癌、乳腺癌等；③患有免疫功能缺陷疾病。95例患者中男52例、女43例，年齡39～78(60.31±6.7)歲，≥60歲35例，<60歲60例。胃癌組織病理檢查結果顯示，組織分化程度(參考第8版美國癌癥聯合會標準[7])：中低分化58例，高分化37例；浸潤深度：T1 20例，T2 25例，T3 32例，T4 18例；組織學分型：腸型38例，彌漫型44例，混合型13例；TNM分期(參考第8版美國癌癥聯合會標準[7])：Ⅰ期20例，Ⅱ期23例，Ⅲ期38例，Ⅳ期14例；有淋巴結轉移66例；腫瘤直徑<4.5 cm 36例，≥4.5 cm 59例。自患者出院起，每1～3個月隨訪1次，包括門診和電話兩種隨訪方式，隨訪時間3～60個月，隨訪至終止時間或患者死亡，隨訪時間截至2019年5月，收集患者生存數據。本研究通過我院倫理委員會批準。

1.2 胃癌及癌旁正常組織中LETM1和HIF-1α表達檢測 采用免疫組化技術(SP法)檢測胃癌及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)中LETM1和HIF-1α表達。將胃癌及癌旁正常組織用甲醛固定后石蠟包埋，切片機切成厚度為3～4 μm的切片，二甲苯脫蠟、無水乙醇水化后PBS緩沖液清洗3次，每次5 min。將切片浸入枸櫞酸緩沖液，100 ℃加熱10 min后自然冷卻，沖洗，3%過氧化氫室溫孵育10 min后滴加100 μL LETM1抗體稀釋液(稀釋比例為1∶100，購自Abnova公司)，HIF-1抗體稀釋液(稀釋比例3∶800，購自Proteintech公司)，4 ℃過夜后清洗，再滴加100 μL聚合物輔助劑(購自中山金橋公司)，室溫孵育20 min。PBS清洗3次后滴加辣根過氧化物酶(購自中山金橋公司)100 μL，同樣室溫孵育20 min后PBS清洗3次，每次2 min。DAB顯色5 min，蘇木素復染4 min，流水沖洗后乙醇梯度水化，最后樹脂膠封片。顯微鏡鏡檢(400×)，選取切片的5個視野，計算5個視野陽性細胞平均百分率，然后根據細胞的染色強度和細胞陽性百分率綜合計算分數[8]：未著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；細胞陽性率<10%為0分，>10%～30%為1分，>30%～50%為2分，>50%為3分。根據以上兩項結果得分相乘，0～2分視為陰性，≥3分為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗；相關性分析使用Spearman相關分析；采用Kaplan-Meier法進行患者預后生存分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌與癌旁正常組織中LETM1和HIF-1α表達比較 胃癌組織中LETM1主要表達于細胞膜上，經免疫組化技術處理后，呈棕褐色染色，而癌旁正常組織無染色或染色較淺。胃癌組織中LETM1陽性表達率為66.3%(63/95)，癌旁正常組織中LETM1陽性表達率為18.9%(18/95)，二者比較差異有統計學意義(χ2=43.57，P<0.05)。胃癌組織中HIF-1α主要表達于細胞核上，經免疫組化技術處理后，呈棕褐色染色，癌旁正常組織無染色或染色較淺。胃癌組織中HIF-1α陽性表達率為60.0%(57/95)，癌旁正常組織中HIF-1α陽性表達率為17.8%(17/95)，二者比較差異有統計學意義(χ2=35.41，P<0.05)。

2.2 胃癌組織中LETM1和HIF-1α表達的關系 Spearman相關分析結果顯示，胃癌組織中LETM1和HIF-1α表達呈正相關(r=0.362，P<0.05)。

2.3 胃癌組織中LETM1、HIF-1α表達與患者臨床病理特征的關系 胃癌組織中LETM1和HIF-1α蛋白表達陽性率與浸潤深度、臨床TNM分期、組織分化程度及淋巴結轉移有關(P均<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑及組織學分型無關(P均>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中LETM1、HIF-1α表達與患者臨床病理特征的關系(例)

2.4 胃癌組織中LETM1和HIF-1α表達與患者預后的關系 95例胃癌患者均隨訪成功，無失訪病例。隨訪5年內，共有42例患者死亡，5年總生存率為55.7%。其中，LETM1陽性63例中死亡32例，5年生存率為49.2%；LETM1陰性32例中死亡10例，5年生存率為68.8%。經Log-rank檢驗，χ2=8.085，P=0.004。HIF-1α陽性57例中死亡29例，5年生存率為49.1%；陰性38例中死亡13例，5年生存率為65.8%。經Log-rank檢驗，χ2=4.965，P=0.025。

3 討論

胃癌是我國常見惡性腫瘤之一，其發病率和病死率遠高于全球平均水平[9]。高鹽飲食、吸煙、飲酒、幽門螺桿菌(Hp)感染均是罹患胃癌的危險因素[1]。雖然近年胃癌發病率有所下降，手術及放化療治療水平不斷提高，但胃癌患者生存率并未得到大幅度提升[10]，且預后差，易復發，患者長期生存率低。

LETM1是一種跨膜蛋白，由疏水端-N端、親水端-C端共同組成，最早發現于一個Wolf-Hirschhorn(WHS綜合征)患者，位于染色體4p16.3，相對分子質量為83.4 kD，并參與多種生物學功能[2]，如跨膜轉運離子、Ca2+、H+及K+等，因此LETM1可平衡線粒體內外的滲透壓，維持線粒體形態，并參與細胞凋亡過程[11]。Doonan等[12]研究發現，下調LETM1表達可引起細胞死亡，減少細胞內線粒體的數量。研究發現，LETM1參與腫瘤細胞的生長及代謝過程，在腫瘤的發生發展過程中起重要作用[13]。本研究中，胃癌組織中LETM1陽性表達率高于癌旁正常組織中，差異有統計學意義。其原因可能為腫瘤組織生長需充足的營養物質及能量，使得腫瘤組織周圍小血管數量增多，進一步使得細胞內線粒體的數量增多，因此線粒體內的LETM1表達上調[13]。本研究結果還顯示，胃癌組織中LETM1表達與腫瘤浸潤深度和轉移有關。機制可能為當LETM1高表達時促進β-catenin、Cyclin D1和c-Myc幾種原癌基因的轉錄，進而激活惡性腫瘤進展中重要的信號通路Wnt/β-catenin，刺激腫瘤細胞分裂、增殖，并隨著血液、淋巴向周圍組織浸潤及遷移[14]。相反地，當抑制LETM1表達時，大部分細胞的增殖周期停滯于S期，對細胞生長產生抑制作用，從而抑制腫瘤細胞遷移和增殖。本研究結果顯示，胃癌組織中LETM1陽性表達率與腫瘤臨床分期、分化程度有關。機制可能為高表達的LETM1使線粒體功能產生障礙，激活糖酵解途徑使ATP生成增加，活化了磷酸酶進而激活PI3K/Akt信號通路，促進腫瘤細胞增殖分化，腫瘤臨床分期、分化程度增高[15]。

HIF-1α是HIF蛋白家族的主要成員之一，其染色體位置為14q21-24，長度約為3 700 bp。HIF-1α是腫瘤微環境中的重要組成部分，在多種惡性腫瘤中均呈高表達，如胰腺癌、乳腺癌[5]，對腫瘤的發生發展及侵襲有重要影響。本研究結果顯示，胃腫瘤組織中HIF-1α表達遠高于癌旁正常組織，機制可能是腫瘤組織生長需形成新的血管及充足能量，導致糖酵解途徑增加，腫瘤組織處于微缺氧環境中，HIF-1α生成增加，促進腫瘤組織適應微缺氧環境[16]。本研究結果顯示，胃癌組織中HIF-1α陽性表達率與腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移有關。機制可能是HIF-1α使其靶基因血管內皮生長因子(VEGF)表達增加[17]，而VEGF是最有效的腫瘤血管生成因子之一，引起血管內皮細胞增殖、遷移和新血管形成，增加了腫瘤細胞轉移及侵襲的機會，進一步促進腫瘤的局部浸潤，促進腫瘤的惡性進展。本研究結果顯示，胃癌組織中HIF-1α陽性表達率與腫瘤臨床分期、組織分化程度有關。其機制可能為HIF-1α激活了Wnt信號通路中的β-catenin和TCF/LEF等蛋白，從而促進了其靶基因的轉錄，進一步促進腫瘤的增殖、分化，使得腫瘤惡性程度升高[18]。

本研究中LETM1和HIF-1α表達陽性者5年生存率均低于陰性者，說明LETM1和HIF-1α的高表達狀態很可能與胃癌患者的預后不良相關，并有可能成為胃癌預后不良的腫瘤標志物。本研究結果還顯示，LETM1和HIF-1α表達存在正相關關系，原因可能為LETM1通過影響線粒體的生物學功能使得HIF-1表達增加，誘導腫瘤周圍組織小血管增生，為腫瘤生長提供營養物質。因此，LETM1和HIF-1α在腫瘤發生發展過程中發揮協同作用，共同促進腫瘤增殖。

綜上所述，胃癌組織中LETM1和HIF-1α表達均升高，二者協同促進胃癌的發生發展；檢測二者表達有助于胃癌診斷及病情判斷。