藍(lán)莓花青素干預(yù)肝硬化大鼠肝組織凋亡蛋白表達(dá)的變化*

汪 可，崔現(xiàn)平，劉麗娟，支慶江，姜文營

肝硬化是一種慢性或持久性肝損傷導(dǎo)致肝組織學(xué)改變的慢性疾病。隨著病情不斷發(fā)展會出現(xiàn)疲勞、黃疸、腹水等表現(xiàn)[1]。肝硬化的病因很多，我國主要由慢性乙型肝炎所導(dǎo)致[2，3]。此外，長期大量飲酒、肥胖、其他病毒感染也是造成肝硬化發(fā)生的病因[4-6]。隨著社會的不斷發(fā)展和飲食文化的變化，肥胖造成的脂肪肝進(jìn)而發(fā)展為肝硬化的患者越來越多，目前已嚴(yán)重威脅國民尤其是青中年群體的身體健康。藍(lán)莓花青素是從藍(lán)莓中提取的一類天然色素，能夠清除機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基，達(dá)到抗衰老、抗氧化的功效，同時也能夠預(yù)防和降低心血管疾病的發(fā)生[7，8]，也有報道認(rèn)為藍(lán)莓花青素還具有抗腫瘤作用[9]。本文主要研究藍(lán)莓花青素對肝硬化大鼠氧化應(yīng)激和肝纖維化的影響，為應(yīng)用藍(lán)莓花青素治療肝硬化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器 SD大鼠30只，體質(zhì)量210～250 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號為SCXK(京)2017-0022。藍(lán)莓花青素購于江西泰誠天然香料有限公司，二乙基亞硝胺購于美國Sigma公司。丙二酸(MDA)試劑盒、Masson染色試劑盒購于美國Bio-Red公司；檢測超氧化物酶(SOD)試劑盒購于南京建成生物公司；檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(Alb)試劑盒購于美國Cayman公司；檢測TNF-α和TGF-β1的ELISA試劑盒購于美國Invitrogen公司。兔抗鼠Bcl-2、抗Bad、抗c-caspase-3、抗β-actin多克隆抗體和蛋白酶抑制劑等購于美國Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購于美國Thermo公司；細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑和其他耗材購于上海生工生物有限公司。DNM-9606酶標(biāo)儀購于北京朗普新技術(shù)有限公司；熒光顯微鏡購于日本Olympus；濕轉(zhuǎn)儀購于美國AB公司；電泳儀購于美國Bio-Red公司；凝膠成像系統(tǒng)購于以色列DNR公司；其他儀器購于德國Eppendorf公司。

1.2 肝硬化大鼠模型的構(gòu)建與處理 將30只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組。給予對照組大鼠生理鹽水10 ml.kg-1灌胃，1次/d；給予模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠二乙基亞硝胺 75 mg.kg-1腹腔注射，1次/d，同時給予模型組生理鹽水10 ml.kg-1灌胃，給予實(shí)驗(yàn)組大鼠藍(lán)莓花青素溶液50 mg.kg-1灌胃，各組大鼠均處理8 w。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，經(jīng)框下竇取血，離心后取血清。取肝組織0.1 g，加入9倍4℃生理鹽水，制備10%肝組織勻漿。取100 μl上清液，加入Buffer，100℃水浴15 min，自然冷卻，3000 r/m離心10 min，取上清置于比色杯，以蒸餾水為參照，測定532 nm波長下的OD值。按試劑盒說明，計算血清MDA和SOD含量。取肝組織，用石蠟包埋、切片，行HE和Masson染色，用乙醇和二甲苯透明，中性樹脂封片，在光鏡下觀察。

1.3 肝組織c-caspase-3、Bax和Bcl2蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法檢測，取肝組織，用剪刀剪成小塊，提取組織總蛋白，在酶標(biāo)儀490 nm波長下行蛋白定量。用12% SDS-PAGE電泳分離，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在4℃條件下依次加入封閉液孵育2 h，加兔抗鼠Bcl-2、抗Bad、抗c-caspase-3、抗β-actin (稀釋比例均為1:1 000) ，孵育過夜。加二抗(稀釋比例均為1:5 000)，孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)檢測分析蛋白條帶，應(yīng)用Image J對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 對照組大鼠肝組織細(xì)胞排列緊密有序，模型組肝組織出現(xiàn)明顯的組織纖維化，實(shí)驗(yàn)組肝組織也出現(xiàn)組織纖維化，但與模型組相比，肝組織纖維化和炎性損傷明顯得到改善(圖1)。

2.2 各組血生化和細(xì)胞因子水平比較 藍(lán)莓花青素處理組動物血清ALT和AST及TNF-α和TGF-β水平顯著低于，而血清白蛋白水平顯著高于模型組(P<0.05，表1)。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)A：對照組(HE，100×)；B：模型組(Masson，400×)；C：藍(lán)莓花青素處理組(Masson，400×)

ALT(U/L)AST(U/L)白蛋白(g/L)TNF-α(ng/L)TGF-β(ng/L)對照組102.47±5.25104.45±3.8737.68±3.080.81±0.050.92±0.07模型組579.87±20.37①428.58±18.25①30.69±2.58①2.56±0.18①2.12±0.15①實(shí)驗(yàn)組371.89±14.72①②148.71±6.34①②34.71±3.34①②1.73±0.11①②1.45±0.12①②

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

2.3 各組肝組織MDA和SOD水平比較 肝硬化大鼠肝組織MDA水平顯著高于，而SOD活性顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 各組肝組織勻漿MDA和SOD水平比較

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

2.4 各組肝組織Bcl-2、Bad和c-caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 肝硬化大鼠肝組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，而Bad和c-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，經(jīng)藍(lán)莓花青素處理動物肝組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bad和c-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)有意義(P<0.05，表3)。

表3 各組肝組織凋亡蛋白表達(dá)水平比較

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

3 討論

肝硬化是由于各種慢性或持久性的肝臟損傷導(dǎo)致肝臟不能正常發(fā)揮功能的慢性疾病，隨著病情不斷發(fā)展會出現(xiàn)疲勞、黃疸、腹水等癥狀和體征，肝組織病理學(xué)檢查會發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的肝組織出現(xiàn)大量結(jié)節(jié)再生和纖維化伴有肝細(xì)胞壞死[10]。患者早期無明顯的指標(biāo)異常，隨著病情不斷發(fā)展會出現(xiàn)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等指標(biāo)升高，發(fā)展到晚期則會出現(xiàn)脾功能亢進(jìn)癥等其他組織器官的損傷[11]。目前，肝硬化的發(fā)病機(jī)制比較統(tǒng)一的認(rèn)識是認(rèn)為由于肝組織成纖維細(xì)胞和星狀細(xì)胞的增殖和遷移，炎癥反應(yīng)引起的氧化應(yīng)激及肝臟細(xì)胞的自身凋亡等，從而誘發(fā)了機(jī)體的免疫反應(yīng)以清除病毒感染，造成肝組織損傷，而在酒精性肝病和脂肪性肝病，各有其不同的發(fā)病機(jī)制[12，13]。

近年來，通過日常飲食和果蔬成分的營養(yǎng)調(diào)節(jié)治療慢性疾病已成為大多數(shù)人群的首選模式，藍(lán)莓花青素是從藍(lán)莓中提取的一類天然色素，對人體的健康有重要的意義，能夠清除機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基，達(dá)到抗衰老和抗氧化的功效，同時也能夠預(yù)防和降低心血管疾病的發(fā)生。也有研究報道認(rèn)為藍(lán)莓花青素還具有抗腫瘤的作用[14-17]。體外研究還發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花青素對乙型肝炎病毒具有一定的抑制作用[18]，因此藍(lán)莓花青素是一種潛在的能改善患者肝硬化的有效藥物成分。本文通過構(gòu)建肝硬化大鼠模型，研究了藍(lán)莓花青素對大鼠肝硬化相關(guān)指標(biāo)的影響，結(jié)果表明藍(lán)莓花青素能夠減輕模型大鼠肝組織纖維化和纖維結(jié)節(jié)。與模型組相比，經(jīng)藍(lán)莓花青素處理的大鼠血清ALT和AST水平明顯降低(P<0.05)。同時，能影響肝臟纖維化的進(jìn)展的TNF-α和TGF-β1也明顯降低。在抗氧化應(yīng)激方面，與對照組相比，模型組大鼠肝組織勻漿MDA含量顯著增加，而SOD含量明顯降低(P<0.05)，經(jīng)藍(lán)莓花青素處理后大鼠肝組織勻漿MDA含量顯著降低，而SOD含量明顯回升(P<0.05)。一般認(rèn)為，肝硬化的發(fā)生發(fā)展與肝細(xì)胞凋亡有一定的關(guān)系。我們采用Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，模型組肝組織抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低，而Bad和c-caspase-3表達(dá)顯著增強(qiáng)。Bcl-2家族蛋白和caspase-3蛋白是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要蛋白[19，20]，研究表明我們構(gòu)建的肝硬化大鼠肝組織確實(shí)存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。經(jīng)過藍(lán)莓花青素處理動物肝組織Bcl-2蛋白表達(dá)顯著提升，而促凋亡蛋白Bad和cleaved-caspase-3的表達(dá)明顯受到抑制(P<0.05)。

綜上所述，藍(lán)莓花青素可能具有肝細(xì)胞保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其能夠下調(diào)TNF-α和TGF-β1表達(dá)，抑制肝纖維化，降低肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制肝細(xì)胞凋亡，這些作用的發(fā)揮可能與調(diào)節(jié)了凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)。藍(lán)莓花青素是一種植物成分，其中起作用的成分復(fù)雜，需要精細(xì)處理和純化，分離出不同的組分，才能深入研究其有效成分。