一株黑枸杞內生真菌紅色素提取工藝及其穩定性分析

韋冠宇，楊小朵，李松澄，鄭敬暉，藍秋菊，劉俊林*

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730110）

色素在日常生活和科研等領域都有重要的應用，由于合成色素的問題越來越來受到人們的關注，因此安全性高、具有一定藥用價值天然色素日益受到人們的認可[1-2]。

微生物色素作為天然色素不受限制，與其他色素具有不可比擬的優越性[3]。天然色素一般穩定性較差，對溫度、pH、氧化劑、添加劑、金屬離子、添加劑等因素非常敏感，其穩定性會隨著環境條件的變化而發生改變[4]，色素的穩定性在一定程度上決定了其應用范圍，由此可知色素穩定性的研究具有非常重要的意義。本文以一株產紅色素枸黑枸杞內生真菌G根7為對研究對象并產生紅色素的穩定性進行一系列探究，為該色素進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 產紅色素菌株

內生真菌G根7，由西北民族大學生命科學與工程學院生物工程實驗室從黑枸杞植株根部分離獲得純化后加入無菌甘油后置于-80℃條件下保存。

1.1.2 試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基,北京索萊寶（Solar-bio）科技有限公司;葡萄糖、瓊脂粉、無水乙醇、乙酸乙酯等試劑均為分析純。

1.1.3 儀器

Nano-drop 1000-UV型分光光度計，日本島津公司；MaxQ436大型落地式恒溫搖床，美國Thermofish ；HWS型智能恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色素的提取

將保存的菌株用接菌環挑取菌絲接于PDA平板培養基活化，待培養基中色素含量飽和后，將菌絲與培養基分離，棄菌絲留含色素的培養基，將其培養基破碎后浸泡在蒸餾水中，料液比為質量：體積＝1：10，1500r/min置于搖床振蕩24h[1]，過濾取上層色素清液，濃縮至30～50ml,真空干燥得粗色素提取物，去離子水稀釋至1mg/mL備用。

1.2.2 色素吸收光譜曲線的測定

取上述1mg/mL紅色素提取液5mL置于比色皿中，以蒸餾水作為對照組，用Nano-drop 1000-UV型分光光度計在波長為320～580nm間進行吸光值測定，以10nm為間隔進行掃描記錄數據，重復測量3次取其平均值繪制光譜曲線，觀察光譜特征，分析確定其最大吸收峰值。

1.2.3 溫度對色素穩定性影響

取50mL濃度為1mg/mL色素溶液置于100mL錐形瓶中，分別于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃恒溫水浴條件下、保溫1h[6]，將其迅速冷卻至常溫觀察顏色變化，以蒸餾水為對照分別測定各條件下最大吸收波長處的吸光值，重復3次實驗取其平均值，分析其在20～100℃溫度范圍內的穩定性。

1.2.4 p H對色素穩定性影響

取5mL濃度為1mg/mL色素溶液，色素溶液與酸堿試劑以3︰1的比例，對照組色素溶液與蒸餾水以3︰1的比例，分別與pH=2、pH=4、pH=6、pH=8、pH=10、pH=12的酸堿試劑分混勻靜置1h后，于分光光度計下分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，重復測量3次取其平均值, 分析不同pH值對色素穩定性。

1.2.5 不同濃度氧化劑對色素穩定性影響

取5mL濃度為1mg/mL色素提取溶液，分別加入3mL濃度為 0mg/mL、0.2 mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0 mg/mL的氧化劑H2O2、Na2SO3溶液，對照組色素溶液加入蒸餾水3mL混合均勻后，觀察溶液顏色變化并于分光光度計下測定其最大吸光值，重復測量3次取其平均值，分析比較其在各氧化劑溶液中的穩定性。

1.2.6 金屬離子對色素的穩定性影響

取5mL濃度為1mg/mL色素提取溶液，分別加入含有3mL濃 度 為 0.5mg/mL 含 有 Ca2+、K+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Pb2+的金屬離子水溶液（溶液中只含一種金屬離子），對照組色素溶液加入蒸餾水3mL混合均勻后,室溫下靜置1h后觀察溶液顏色變化，并于分光光度計下測定其最大吸光值，重復3次實驗取其平均值。分析比較其在各金屬離子溶液中的穩定性。

1.2.7 不同添加劑對色素的影響

取5mL濃度為1mg/mL色素提取溶液，分別加入含有3mL濃度為0.5mg/mL含有山梨醇、淀粉、酒石酸鉀鈉、檸檬酸、葡萄糖、蔗糖、乳糖的水溶液，對照組色素溶液加入蒸餾水3mL混合均勻后,室溫下靜置1h后觀察溶液顏色變化，并于分光光度計下測定其最大吸光值，重復3次實驗取其平均值，分析比較其在不同添加劑溶液中的穩定性。

2 結果與分析

2.1 產紅色素內生真菌G根7菌株及色素提取液

圖 1 菌株正面

圖 2 菌株背面

圖 3 色素提取液

2.2 色素特征吸收光譜曲線

圖4 為紅色素在320～580nm(每隔10nm測量一次)范圍內用可見分光光度計測試形成的圖譜。圖可知該色素在可見光范圍內有2個吸收峰，最大吸收峰為390nm其對應的最大吸光度值為1.04。

圖4色素特征吸收光譜曲線

2.3 溫度對色素穩定性影響結果

圖5 所示，該色素在20～100℃溫度范圍內能存在,在該溫度范圍內處理后，觀察顏色無太大變化，再將其置于可見分光光度計下測定其吸光值，發現在溫度在達到60℃之后，該色素的吸光值有較為明顯的下降，證明該色素不耐高溫。

圖5 溫度對色素穩定性影響

2.4 pH對色素穩定性影響

如圖6所示，該色素在pH=2～12范圍內能穩定存在,在pH=2～12 范圍內作用后發現顏色無明顯變化，將其放置于可見分光光度計下測定其吸光值，測量結果發現在pH=4～8時，色素出現較為明顯的增色效應，且無明顯的化學反應發生。說明該紅色素在一定酸堿條件下能穩定存在，便于實際生活中應用，由測量結果可知該色素在酸性條件下的增色作用強于堿性條件。

圖6 不同pH值對色素穩定性影響

2.5 不同濃度氧化劑對色素穩定性影響

由圖7顯示氧化劑對該紅色素的影響比較大，不同濃度的氧化劑的該紅色素的作用不同，結果表明0.8mg/mLNa2SO3溶液對該色素色澤有明顯的增強作用，并且Na2SO3溶液的護色作用強于 H2O2溶液。

圖7 不同濃度氧化劑對色素穩定性影響

2.6 金屬離子對色素的穩定性影響

由 圖 7 可 知 該 紅 色 素 在 Ca2+、K+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Pb2+的金屬離子水溶液中能穩定存在，但各離子對色素的作用效果不盡相同。通過實驗結果表明：Fe2+和Al3+對該色素有明顯的護色作用。

圖8 金屬離子對色素的穩定性影響

2.7 不同添加劑對色素的影響

由圖8可只在實驗中所加人的不同添加劑中，淀粉對該紅色素的的護色有明顯的增強作用，在波長390nm的條件下測得的吸光值為1.435，是其他添加劑的3.5倍。猜想該色素有良好的染色作用，可用于一些紡織品的染色。

圖9 不同添加劑對色素的影響

3 結論與展望

本研究在黑枸杞根部中分離出一株產紅色素的內生真菌G根7，通過PDA培養基培養發現其能產生紅色素，且該色素為水溶性色素，便于提取分離。實驗結果顯示該色素在20℃～100℃的條件下穩定存在，在一定范圍內不必擔心因溫度問題而造成色素品質下降。在p H=4～8時，色素出現較為明顯的增色效應，且無明顯的化學反應發生。在生產實踐中可適量加入亞硫酸鈉以提高色素品質，使顏色更鮮艷。金屬離子Fe2+、Al3+對該色素都有明顯增色作用，在非食品實際生產中可適量加入其中之一[5]，提高產品色澤。本文所提取的紅色素是藥用植物枸杞內生真菌的次生代謝產物，其與枸杞長期共生可能產生與之具有相同或相似作用的活性物質[6]，筆者猜想可用于抗氧化、抗衰老、抗菌等方面的保健品或藥品的研究。但該色素在純化處理、理化性質、基本結構，食用安全上還有待進一步的深入研究，以期為化妝品、食品行業等做出一定的貢獻[7]。