應(yīng)用NAT檢測獻(xiàn)血者HBsAg ELISA灰區(qū)樣本的探討

汪鵬 宋曉艷 張瑞萍

【摘要】

目的：對獻(xiàn)血者血樣HBsAg ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）檢測為“灰區(qū)”的樣本進(jìn)行核酸檢測（NAT），分析灰區(qū)樣本核酸檢測的結(jié)果以及核酸檢測為陽性結(jié)果樣本酶聯(lián)免疫檢測情況，探討獻(xiàn)血者HBsAg 酶聯(lián)免疫檢測灰區(qū)的設(shè)置。 方法：先對2016-2017年獻(xiàn)血者56794例血樣進(jìn)行HBsAg 酶聯(lián)免疫檢測，再對Cut off值為0.5≤S/CO<1的366例樣本進(jìn)行核酸檢測，統(tǒng)計分析檢測結(jié)果。 結(jié)果：366例灰區(qū)樣本單試劑雙孔復(fù)檢后無反應(yīng)性147例，有反應(yīng)性 219例。核酸檢測陽性27例，其中24例酶聯(lián)免疫檢測無反應(yīng)性，2例為單試劑反應(yīng)性，1例為灰區(qū)樣本。結(jié)論：獻(xiàn)血者血液開展核酸檢測技術(shù)后，HBsAg酶聯(lián)免疫檢測可不設(shè)置灰區(qū);核酸技術(shù)與酶聯(lián)免疫技術(shù)聯(lián)合檢測，更加保證獻(xiàn)血者血液安全。

【關(guān)鍵詞】HBV 灰區(qū);酶聯(lián)免疫吸附試驗;核酸檢測

【中圖分類號】 R365 ? ? ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B ? ? 【文章編號】2095-6851（2020）06-127-01

我國是HBV高感染的國家，“隱匿性”或“窗口期”感染可能是輸血傳播HBV的主要潛在危險因素。血站系統(tǒng)主要采用兩遍酶聯(lián)免疫和一遍核酸檢測對獻(xiàn)血者血液進(jìn)行篩查。由于酶聯(lián)免疫方法是一種半定量試驗，檢測的過程會導(dǎo)致檢測結(jié)果變異系數(shù)較大，使得灰區(qū)的范圍相對較寬，酶聯(lián)免疫單試劑檢測不合格的比例遠(yuǎn)大于雙試劑檢測不合格的比例[1]。假陽性檢測結(jié)果增加血站向獻(xiàn)血者解釋的難度，同時增加獻(xiàn)血者的心里負(fù)擔(dān)，更增加了血液資源的浪費。核酸檢測不僅能使輸血傳播病原體的殘余風(fēng)險降低，還能縮短病毒感染后檢測的窗口期，在檢測隱匿性HBV感染方面具有重要意義[2]。筆者以本站2016-2017年HBV酶聯(lián)免疫檢測“灰區(qū)”樣本366例為研究對象，分析灰區(qū)樣本復(fù)查的結(jié)果及核酸檢測結(jié)果，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016-2017年我站酶聯(lián)免疫檢測為灰區(qū)的樣本366例為研究對象，所有樣本均按照國家法律規(guī)范進(jìn)行HBV酶聯(lián)免疫雙試劑檢測，選取單試劑檢測灰區(qū)的樣本進(jìn)行核酸檢測。

1.2 檢測儀器和試劑 儀器：HAMILTON STAR全自動加樣儀、FAME 24/20全自動酶聯(lián)免疫儀、HAMILTON STAR 全自動核酸提取儀、DA3000提取儀、AFD9600熒光PCR擴(kuò)增儀、ABI7500熒光PCR擴(kuò)增儀。酶聯(lián)免疫試劑：乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（上?？迫A）、乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（北京萬泰）。核酸檢測試劑：達(dá)安基因HBV-DNA/HCV-RNA/HIV-RNA（1型）核酸檢測試劑（PCR-熒光法）;華益美HBV-DNA/HCV-RNA/HIV-RNA（1型+2型）核酸檢測試劑（PCR-熒光法）。儀器設(shè)備均處于正常使用狀態(tài)，試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫檢測 按照血站技術(shù)操作規(guī)程（2015版）[3]規(guī)定對獻(xiàn)血者樣本進(jìn)行酶聯(lián)免疫初復(fù)檢檢測，設(shè)定檢測值/臨界值（S/CO）在0.5～1.0為實驗室的灰區(qū)檢測范圍，初次檢測處于灰區(qū)的樣本再用該廠家試劑雙孔復(fù)檢，復(fù)檢無反應(yīng)性判為合格，復(fù)檢有一孔或兩孔有反應(yīng)性的判為不合格。

1.3.2 核酸檢測 挑選酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果無反應(yīng)性的和HBsAg單試劑檢測有反應(yīng)性的所有樣本采用8混樣模式進(jìn)行核酸檢測，混檢陽性孔樣本再進(jìn)行拆分檢測。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：有明顯S型擴(kuò)增曲線且標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤45，則結(jié)果判為有反應(yīng)性;陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)：無明顯S型擴(kuò)增曲線，標(biāo)本檢測結(jié)果的Ct值為“無值”，且相應(yīng)的內(nèi)對照結(jié)果Ct值≤40，如果檢測的是混合樣本，則判定組成該初級混合樣本的8個樣本為陰性。

1.4 統(tǒng)計 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析

2 結(jié)果

2.1 2016-2017年HBsAg 酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果（見表1）

? 2.2 2016-2017年HBV 核酸檢測結(jié)果（見表2）

? 2.3 2016-2017年酶聯(lián)免疫灰區(qū)樣本核酸檢測結(jié)果（見表3）

? 2.4 2016-2017年酶聯(lián)免疫檢測為灰區(qū)樣本的核酸檢測結(jié)果（見表4）

3 討論

3.1 我國是世界人口大國，HBV感染率相對較高，輸血傳播是主要的感染途徑，HBsAg是HBV標(biāo)志物之一，可以反應(yīng)HBV感染情況。血站目前采用兩遍酶聯(lián)免疫和一遍核酸模式對獻(xiàn)血者血液進(jìn)行篩查，不同的酶聯(lián)免疫試劑在血液HBsAg篩查中，表現(xiàn)出不同的靈敏度和特異性，可能是不同試劑廠家的材料來源、檢測限、試劑純度方面差異較大[4]，從表1看出，北京萬泰HBV試劑初檢灰區(qū)樣本266（0.73）例，高于上?？迫A100（0.27）例，兩者之間比較（P<0.005）有顯著性差異，北京萬泰試劑復(fù)檢后無反應(yīng)性121（45.48）例，有反應(yīng)性145（54.52）例，上海科華復(fù)檢后陰性26（26.00），有反應(yīng)性74（74.00）。

3.2 目前國內(nèi)對灰區(qū)臨界設(shè)置并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有文獻(xiàn)報道設(shè)定在0.9-1.1倍CO值區(qū)域，也有學(xué)者認(rèn)為可以設(shè)置在CO值20%的范圍內(nèi)。統(tǒng)計表1、表2、表3中看出乙肝酶聯(lián)免疫初次檢測為灰區(qū)366例的樣本，單試劑雙孔復(fù)檢后陰性147例，陽性219例。核酸檢測后陽性27例，其中24例酶聯(lián)免疫檢測陰性，2例為酶聯(lián)免疫檢測單試劑陽性，1例為酶聯(lián)免疫檢測灰區(qū)樣本。衛(wèi)生部臨床檢驗中心對我們送檢的6例核酸檢測樣本進(jìn)行了確證，其中3例確證是乙肝感染。

3.3 從表4中可以看出，酶聯(lián)免疫單試劑復(fù)檢有反應(yīng)性樣本219例，核酸檢測218例無反應(yīng)性（99.54%），僅有1例酶聯(lián)免疫復(fù)檢有反應(yīng)性，核酸檢測陽性。但是單試劑復(fù)檢有反應(yīng)性的血液已報廢，如果設(shè)置有酶聯(lián)免疫灰區(qū)，會導(dǎo)致假陽性率增加（0.38%，218/56794），造成血液的浪費。所以血站開展核酸檢測后，灰區(qū)的設(shè)置是不必要的。

3.4 核酸檢測能夠縮短乙肝病毒感染的窗口期，其方法的敏感性和特異性優(yōu)于酶聯(lián)免疫檢測，但是核酸檢測對血液標(biāo)本、檢測環(huán)境及操作人員技術(shù)水平要求較高，如果檢測前試劑、樣本質(zhì)量不能保證質(zhì)量，核酸檢測結(jié)果也難以保證準(zhǔn)確，酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)成熟，操作相對簡單，對設(shè)備要求不高，二者聯(lián)合互補(bǔ)應(yīng)用，更加能保證臨床用血的安全。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鄧雪蓮，安萬新，梁曉華等.大連市血液中心血清學(xué)檢測與核酸檢測并行的效果觀察[J].中國輸血雜志，2012，25（1）：38-40

[2] 鄭劍婷，核酸檢測與酶聯(lián)免疫吸附檢測在無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本乙肝病毒篩查中的應(yīng)用比較.按摩與康復(fù)學(xué)，2018，9（3）：91-92

[3] 血站技術(shù)操作規(guī)程（2015版）

[4] 馮娟，血站HBsAg反應(yīng)性樣本的ELISA與PCR法檢測結(jié)果的相關(guān)性.臨床輸血與檢驗，2016，18（1）：47-50