應用熒光定量PCR技術檢測小兒尿液中人巨細胞病毒

袁成立

【中圖分類號】R821.4+2 ? ? ? 【文獻標識碼】B ? ? 【文章編號】2095-6851（2020）06-069-01

巨細胞病毒（CMV）感染主要源自于人巨細胞病毒（HCMV） ，具有較強易感性，可在任意季節肆意增殖，臨床研究表明該病成人感染率高達95%，而大部分患者感染該病后無明顯癥狀表現，病毒潛伏期較長。而一旦感染體免疫功能弱化，則可直接激活潛伏病毒，導致靶器官傷損傷，情況嚴重下可致死。

巨細胞病毒的主要靶器官主要針對肝臟、呼吸系統、神經系統以及血液系統。由于兒童（包括嬰兒、新生兒）的抵抗力、免疫力較低，感染風險較高，臨床癥狀主要表現為黃疸、溶血性貧血或智力低下等，可致畸、致殘甚至致死。新生兒感染CMV的主要因素及途徑是HCMV母嬰傳播，HCMV可直接穿透胎盤而造成感染。有研究指出，孕婦CMV若為非活動性感染，則發生垂直傳導傳播的風險較低，因此CMV DNA陽性不可作為終止妊娠的獨立危險證據。若病毒DNA含量少，幾乎不影響正常妊娠。而對此現階段隨著特異性抗CMV病毒更昔洛韋等藥物的廣泛應用，如何早期、迅速且精確診斷CMV感染，是檢測CMV感染程度及動態，開展合理治療與評估療效、預后的關鍵依據。

現階段診斷HCMN感染的金標準主要是病原體分離，而因分離技術條件較差且分離時間較長，臨床實驗室內難以廣泛應用。近年多使用血清學及分子生物學等方法輔助診斷HCMN感染。但結合上文所述，新生兒的HCMV-IgG抗體表達嬰兒后期經胎盤獲取的母體抗體，最多只能存在約18個月，因此也無法作為診斷兒童HCMV感染的唯一依據。而經IgM試驗假陽性與假陰性過于一致，加之兒童的體液免疫系統尚未完善，免疫應答有效性存在一定局限性，因此血清學方法不宜適用于檢查診斷HCMN感染。

EISA是現階段臨床應用率較高的檢測技術之一，采用EISA法檢測CMVIgM抗體是臨床診斷活動性CMV的關鍵指標，主要出現于感染后3～5d，持續發展3～6個月，大多表示為近期活動性感染;若為IgM陰性，推斷可能原因為處于感染初期，尚不具抗體或感染后抗體完全消失。而IgM陽性并不是診斷原發性感染的金標準，無法作為診斷CMV的唯一證據。由于風濕因子，以往遺留感染及皰疹病毒產生交叉反應，均可造成假陽性，且無法作為評估藥物療效與患者預后狀況的定性、定量指標。

而FQ-PCR可迅速且定量檢測CMV DNA，該技術基于熒光信號檢測PCR產物，其不僅顯著提升靈敏度，同時具有PCR循環一次即可采集一個數據的優勢，實時構建增發曲線，精確明確CT值，進而憑借該CT值明確始末的DNA拷貝指數。相較于常規PCR，其優勢在于特異性強、靈敏度高、定量精確、設備線上實檢測、結果簡易可視化等，可防止醫師主觀判斷，檢測重復性較好，自動化可操控性較高，此外有效規避了PCR污染問題。其靈敏度是每個反應體系的100個病毒粒子，大于常規PCR檢測敏感性約1±0.5個數量級，且檢測的有效線性范圍得到拓寬，可動態檢測體內CMV。其主要根據基因擴增數量及趨勢，作為病情、預后評估的實質性依據，可精確反映所用藥物是否對病原體濃度的變化產生影響，有助于評估藥效，為后續用藥方案的制定提供實質性的參考。

CMV侵入管道上皮細胞的風險較高，尤其是腎臟、肝膽系統。病毒集中于腎小管，CMV主要在腎小球、腎小管上皮細胞內繁殖，經尿液排出。由于尿液具有較強的濃縮功能，因而尿液中病毒含量通常較高。其次HCMN可在細胞內發生和發展，而血液中僅可釋放少量病毒，加之檢測方法存在一定局限性，其檢出病毒含量較少，很大程度上是造成FQ-PCR血液標本陽性率較低的關鍵因素。因而可借助尿液檢測CMV DNA，檢出陽性率較高。加之采集兒童尿液的便捷性優于血液，后期藥物治療、隨訪中均可采集標本實現持續性檢測，有利于提升檢測動態結果的實效性。而目前臨床已有大量研究證實，檢測尿CMVDNA可為診斷嬰幼兒CMV感染提供實質性的輔助。

臨床有相關研究對75例臨床疑似患有HCMV活動性感染患兒的血、尿標本中，檢出尿液HCMV陽性57例，檢出率高達達77.33%，高于常規pp65抗原檢測的64.22%，由此可見FQ- PCR檢測HCMV的敏感性、精確性明顯高于常規pp65抗原血癥檢測。而兩項檢測結果的一致性高達（86.78%），因此可表明，尿液中檢出高濃度的HCMV可作為有效提示體內病毒活躍程度的關鍵依據。而該項實驗中，兩種檢測方法均檢出3例陽性標本，本文結合以上論述，推斷原因可能在于各個群體宿主免疫狀態的差異、HCMV潛伏后重新激活感染的病理表現、癥狀表現均具有一定差異等。考慮到HCMV感染的臨床表現較為綜合、復雜，因而臨床上務必綜合判斷分析各指征，保證及時、精確、合理診斷HCMV的發生、發展與分化。

總的來說，將尿液作為臨床檢測小兒HCMV感染的一線標本，具有取材便捷、前期預處理便捷、結果敏感性高等優點，對臨床及時診斷CMV感染與療效評估具有實質性的輔助價值，且一定程度上有助于改善妊娠結局，防止分娩畸形兒，切實保障母嬰健康。而對CMV DNA的檢測而言，將作為診斷CMV感染繼續以標準化、多元化優創新創效發展的引領方向。