基于RBC睴CS睩e3O4磁性納米粒子自組裝與磁控制癌細胞運動的研究

彭逸舟 段金娣

摘 要：晚期癌癥的高死亡率迫使科學家尋找新的治療方案，判定癌癥晚期的直接指標就是有遠處的轉移發(fā)病灶，癌細胞的轉移途徑主要以血行轉移為主，應用Fe3O4對進入循環(huán)系統(tǒng)的癌細胞磁分離研究應運而生，本課題以紅細胞膜、殼寡糖、Fe3O4共組裝的新型磁性粒子用于賦予癌細胞磁響應性，用磁場引導癌細胞運動。該粒子具有長循環(huán)性，磁響應性且有針對不同癌細胞裝載不同治療藥物的潛能。

關鍵詞：癌細胞磁性控制;紅細胞膜;靶向;吸附

目前癌癥仍然是威脅著全世界人類的一大疾病殺手，由于癌癥發(fā)病隱匿，早期進程中，病人因幾乎難有臨床癥狀而忽略檢查，當癌癥癥狀如擠壓器官壓迫神經引發(fā)疼痛等情況的產生往往發(fā)生在已有癌細胞轉移的IV期，晚期病人的低治愈率和高死亡率呼喚著科學家采取積極的應對措施，癌癥IV期時，出現(xiàn)的遠處臟器的轉移大多數(shù)是由血行轉移的，從入血這個階段開始通過各種手段把癌細胞從血中分離清除掉，可減低癌細胞擴散的速度，降低實質臟器因癌細胞轉移入侵的損害機率。基于磁動力學原理設計出的癌細胞磁分離技術是一種成本低效率高效果顯著的方法，這是目前新提出的一種有效清除血液中的癌細胞的治療兼并檢測技術。

殼寡糖有著出色的分散穩(wěn)定性和對多種分子和離子高度親和吸附的性能，其多氨基和多羥基結構易于形成氫鍵，易于修飾納米粒子和脂質膜的層層組裝。Fe3O4有靈敏的磁響應性、易制備性還有顯著的加速傳質傳熱的性能，有利于賦予周圍結構磁響應性和向周圍動量熱量的傳遞，用來做磁珠光熱療法的極好材料。紅細胞膜通過與殼寡糖的粘附性在納米粒子周圍包裹上一層柔性脂質膜，形成有彈性的復合殼寡糖—脂質體外殼，能緩沖金屬氧化物粒子的硬度，以減低納米粒子群在血流中運動時對周圍細胞組織的摩擦性損害，同時降低單個粒子密度，提高懸浮穩(wěn)定性，阻隔磁性粒子間的團聚沉降，減少血管被阻塞的可能，膜上的蛋白質和特異性糖原，能給予納米粒子有效的偽裝性，使之在血液中逃避掉免疫細胞的識別和吞噬，能在血中起到長循環(huán)的效果，使之有充分的時間尋找和靶向吸附癌細胞。

一、納米粒子的制備過程

殼寡糖共混入三口燒瓶，加入200ml去離子水，超聲30s，溶解混勻，將Ar2瓶用長針頭一側口插入燒瓶，主口裝氣球，另一側口插入細針頭，45攝氏度下攪拌20min，用注射器逐滴加入TPP，見黃色透明溶液變成半透明黃色乳光液，升溫至60攝氏度再度攪拌10min，逐滴加入NaOH，見黃色溶液從中間開始漸變?yōu)榧t色，隨pH值升高，繼發(fā)變成全黑色，即停止加堿，最高轉速攪拌3h，升溫至80攝氏度，停攪拌靜置熟化30min，磁分離粒子，用乙醇和水洗滌至中性，真空干燥12h，收集回深咖啡色粉末，研磨稱重。

去纖維化抗凝羊血（300ml），離心，去上清，用冰PBS洗滌，反復四至五次，用冰1/4PBS低滲破碎細胞膜1h，離心，去上清，用冰PBS洗滌，反復多次，可超聲破碎1-2次，直到留下粉色或白色細胞膜沉淀，超聲20min，4攝氏度保存。牛黃膽酸鈉，紅細胞膜，混合溶入10ml乙醇，超聲混勻后裝入注射器，迅速注入45攝氏度PBS溶液100ml，旋蒸20min，DSPE-PEG-FA、DSPE-PEG-FITC，紅細胞膜∶DSPE-PEG-X=20∶1（M/M）混合37攝氏度攪拌1小時。再用脂質體擠出器擠出七次，4攝氏度13000r/min離心，冰PBS洗滌，超聲重分散，反復三次，4攝氏度PBS保存。將由本課題組2019級的本科畢業(yè)生段金娣配制的用油酸鈉和聚乙二醇6000制成分散劑溶液與OCS-Fe3O4粒子共混超聲5min，紅細胞膜與Fe3O4粒子共混攪拌加熱至45攝氏度，擠出器45攝氏度水浴，再將Whatman膜放入脂質體擠出器，多次擠出。離心去上清，再超聲數(shù)十秒重分散在PBS溶劑里。反復三次后，50nm超濾膜過濾48h。

細胞表征實驗：癌細胞與納米粒子靶向親和力檢測：將修飾好熒光劑的納米粒子與癌細胞混合均勻共孵育48h，再用胰酶消化，吹打，種板24h后，用高內涵拍照。培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下，在一邊放上磁鐵，拍下癌細胞隨磁場的運動。

由實驗結果可知，納米粒子高度分散性和穩(wěn)定性，磁性粒子與癌細胞吸附后，可充分賦予癌細胞磁響應性，可隨磁場運動。

二、結論

本文以Fe3O4為磁核材料，殼寡糖OCS為分散劑和穩(wěn)定劑，紅細胞膜作為免疫逃避保護膜，用同步吸附共沉淀法和高壓擠出法制備出用于在全血中分離癌細胞的納米磁珠紅細胞膜-OCS-Fe3O4其能精準充分賦予癌細胞磁響應性，其能在人工磁場中被磁力吸引運動。綜上所述，本文合成了一種可靶向賦予癌細胞磁響應性的長循環(huán)納米粒子，可用于控制癌細胞從血細胞中磁性分離，為癌細胞透析的臨床應用提供了基礎性研究。

參考文獻：

[1]M.S.Sivakamia Thandapani Gomathib Jayachandran Venkatesanc Hee-Seok Jeongc Se-KwonKimc P.N.Sudhaa，Preparation and characterization of nano chitosan for treatment wastewaters，International Journal of Biological Macromolecules.2013.

[2]Zohra Mohammedi Chitosan and Chitosan Oligosaccharides：Applications in Medicine，Agriculture and Biotechnology，Mustapha Stambouli University，Mamounia，Mascara，Algeria，International Journal of Bioorganic Chemistry，2017.

[3]李偉殼.聚糖基納米復合材料的構建及在電負性污染物處理中的應用.武漢大學，2010.