一株裂殖酵母乙酸乙酯發酵條件的優化

武藝

（河北衡水老白干酒業股份有限公司，河北衡水 053000）

乙酸乙酯是一種具有水果香味的揮發性酯，適量的乙酸乙酯可以提高衡水老白干香型白酒的品質，使白酒香氣優雅怡人。通過產酯酵母菌液強化大曲，可以提高老白干基酒的優級率，增加經濟效益。

白酒生產中常見產酯酵母對乙醇親和力很強，以乙醇作碳源能發育很好，而且又有較強的氧化性。乙醇能增進產酯酵母的呼吸作用，與酯發酵之間存在特殊關聯。產酯酵母具有一定的酒精發酵能力，又具備醋酸發酵能力。在白酒生產中使用最多的產酯酵母是漢遜酵母，其次是球擬酵母和假絲酵母。在白酒生產中添加適量的產酯酵母，增加乙酸乙酯在發酵酒醅中的含量，對增加白酒的風味成分、保證和穩定酒質十分重要[1]。本實驗采用菌種由衡水老白干酒大曲中分離篩選獲得，其產酸產酯能力較顯著。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

葡萄糖(北京陸橋技術股份有限公司)、蛋白胨(安琪公司)為分析純；酵母粉由安琪公司提供。

1.1.2 主要設備

7890A型氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；搖床，太倉實驗設備廠；SW-CJ-2FD型超凈臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；TGL-16型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；0.22 μm微孔濾膜，九鼎高科過濾設備有限公司。

1.1.3 培養基[2]

種子培養基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%；發酵培養基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%。

1.2 實驗方法[3]

1.2.1 菌種擴大培養

將斜面種子接入種子培養基中，搖床28 ℃培養24 h，搖床轉速220 r/min。培養成熟后接入發酵培養基，接種量為5%。

1.2.2 正交實驗設計

采用正交試驗來探索最優的產酯條件。確定發酵溫度（A）、前體乙酸初始酸度（B）、前體起始酒精度（C）3個因素為影響因素[4]。如表1所示，每個因素取3個水平，按L9（34）進行正交試驗設計，以乙酸乙酯作為評價指標進行分析。

表1 正交試驗因素與水平

1.2.3 乙酸乙酯的測定

吸取發酵液 5 mL，4 000 r/min 條件下離心 10 min，吸取上清液1 mL，稀釋后過0.22 μm微孔濾膜后進行色譜檢測。每個樣品取3個平行樣。

2 結果與分析

2.1 發酵條件的優選

正交試驗結果見表2和顯著性分析見表3。由表2可知，L9（34）正交試驗中大部分實驗組乙酸乙酯在第5 d達到最大值。由表3可知，以乙酸乙酯為評價指標，各因素對其影響強度為發酵溫度＞起始酸度＞起始酒精度，其中因素A、B均顯著，且A因素較為顯著，C因素不顯著。直觀分析表明乙酸乙酯濃度最高組合為A2B2C3，即發酵溫度28 ℃，起始酸度0.2%，起始酒精度5%。

2.2 驗證試驗

根據正交實驗結果，進行3次實驗驗證A2B2C3組合，實驗結果為 37.90 mg/100 mL 、38.50 mg/100 mL、38.80 mg/100 mL，平均值為 38.40 mg/100 mL。

2.3 后續試驗

2.3.1 乙酸乙酯的變化

發酵后期至第6 d后，乙酸乙酯濃度變化加大，規律性紊亂，考慮誤差原因，有些樣品乙酸乙酯濃度變化在每日50%左右，可能是由于底物濃度變化和揮發或后期分解所致，其變化規律有待進一步研究。

表2 乙酸乙酯發酵條件L9（34）正交試驗結果

表3 顯著性檢驗

2.3.2 酒精濃度的影響

發酵后期酒精濃度的顯著性有很大提高，個別起始酒精濃度5%的樣品達到60 mg/100 mL以上，而起始酒精濃度4%的樣品大多徘徊在45 mg/100 mL。

3 結論

通過正交實驗，以乙酸乙酯產率為評價指標，各因素對其影響強度為發酵溫度＞起始酸度＞起始酒精度，當溫度28 ℃、起始酸度0.2%、起始酒精度5%時，所得乙酸乙酯濃度最高，為 37.70 mg/100 mL。

未來考慮將發酵至對數期的發酵液作為增酯強化液潑入酒醅，與酒醅一同發酵，并通過后續實驗，不斷優化工藝切入點，