旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的原理及應用

來元亮

（上海奧尚生物科技有限公司，上海 200090）

細胞培養(yǎng)在整個生物技術(shù)工程中是一個必不可少的步驟，也是最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的出現(xiàn)使得細胞的培養(yǎng)過程更加順利，效果也更符合人們的需求。本文分析細胞培養(yǎng)裝置的現(xiàn)狀，闡述旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的概念，并介紹這一系統(tǒng)的作用原理、優(yōu)勢及應用。

1 細胞培養(yǎng)裝置研究現(xiàn)狀

雖然在目前已掌握的微生物技術(shù)中，工業(yè)培養(yǎng)微生物的技術(shù)已經(jīng)發(fā)展得比較完善，但是這種微生物技術(shù)主要還是用于培養(yǎng)一些細菌以及藻類的蛋白質(zhì)細胞。這類細胞的外層有牢固的細胞壁，生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)條件比較簡單，屬于容易培養(yǎng)的一類細胞。哺乳類動物細胞所需要的營養(yǎng)物質(zhì)條件要求高，細胞大且脆弱，還不能進行游離生活，大多數(shù)要直接附著在某種哺乳類生物的細胞表面才能繼續(xù)生長[1]。所以，就目前的細胞培養(yǎng)技術(shù)而言，大量培養(yǎng)哺乳類細胞是一個艱巨的任務。初期，研究人員通過微珠轉(zhuǎn)瓶等方法來直接培養(yǎng)動物細胞，但是只能少量培養(yǎng)成功[2-3]。此后有研究者利用一種高密度的微載體細胞培養(yǎng)技術(shù)來直接培養(yǎng)更多的哺乳類細胞，利用微珠作為一種載體，使細胞直接生長在其表面。這種用微珠來培養(yǎng)細胞的方法一定程度上提高了哺乳類細胞的培養(yǎng)量[4-6]。但是隨著哺乳類細胞的生長發(fā)育，細胞周圍有利營養(yǎng)物質(zhì)會逐漸減少，而排泄的垃圾和有害物質(zhì)會逐漸增多。為了使生長的哺乳類細胞不斷接觸到有利的物質(zhì)條件，通過分散和懸浮微珠，不斷供給有利的物質(zhì)條件并排出廢液，以此來培養(yǎng)更多的細胞[7-8]。旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的出現(xiàn)，使細胞培養(yǎng)的成活率逐漸升高，效率加快，已成為目前世界上最為理想的細胞培養(yǎng)裝置[9-10]。

2 旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)簡介

旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（The Rotary Cell Culture System，RCCS）可以有效培養(yǎng)貼壁和懸浮的三維細胞，是目前已知世界上最為理想的細胞培養(yǎng)裝置。這一系統(tǒng)最先出現(xiàn)在美國約翰遜航天中心，發(fā)明者最初的設計目的是為了保護在美國宇航局中進行纖細的組織培養(yǎng)。這種細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠用來培養(yǎng)其他不能輕易進行細胞培養(yǎng)的三維細胞和各種高密度的三維細胞。低剪切力、高化學物質(zhì)能量傳遞效率以及微重力的獨特培養(yǎng)環(huán)境是RCCS容器的獨特培養(yǎng)特點，這種特點也使得研究者能夠在普通的實驗室中培養(yǎng)出三維的細胞組織。

目前已知有2種基本的RCCS細胞培養(yǎng)容器[11]：第一種是長圓柱形容器（STLV）（圖1），容器呈管狀，中央的氣體交換膜芯是為了培養(yǎng)貼壁細胞而設計的；第二種是高精度截面縱橫比細胞培養(yǎng)容器（HARV）（圖2），這是一種盤狀懸浮細胞培養(yǎng)容器，其內(nèi)壁主要由氧交換細胞膜組成，是為了方便培養(yǎng)懸浮細胞而設計的。

圖1 長圓柱形RCCS細胞培養(yǎng)容器（STLV）

圖2 高精度截面縱橫比細胞培養(yǎng)容器（HARV）

3 RCCS的工作原理

旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要由同軸旋轉(zhuǎn)的氧化器和細胞培養(yǎng)皿組成。系統(tǒng)工作時，培養(yǎng)皿內(nèi)部已經(jīng)充滿了大量培養(yǎng)基，且這些培養(yǎng)基可以像固體一樣緊緊圍著水平軸進行轉(zhuǎn)動。在這一過程中，培養(yǎng)基均以相同的角速度轉(zhuǎn)動，使得培養(yǎng)皿內(nèi)產(chǎn)生層流并具有最小的剪切力；培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的細胞由離心力、重力以及科式力共同作用而變成懸浮狀態(tài)。所以在RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的細胞不僅受到最小的機械外力，還能夠得到最充足的營養(yǎng)以及氧氣等必備物質(zhì)，因此而聚集形成了類組織聚合物。在旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，懸浮的細胞可以產(chǎn)生一個液體懸浮軌道；而隨著細胞的不斷生長，研究者可以隨意調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)速度，以此來抵償沉降速率[12]。

4 RCCS的優(yōu)勢

在RCCS的液體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中的各種液體培養(yǎng)物質(zhì)都隨著RCCS容器在電機驅(qū)動作用下沿細胞的水平軸方向旋轉(zhuǎn)[13]。在細胞的水平軸內(nèi)，細胞顆粒可以很容易地建立起一個細胞懸浮軌道，使得細胞培養(yǎng)基以及細胞顆粒都會隨著培養(yǎng)系統(tǒng)一起旋轉(zhuǎn)，而這些細胞顆粒又不會與培養(yǎng)容器壁或其他生物體相互接觸或碰撞；加上培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)部沒有其他外力，使得細胞或者組織在生長過程中受到的破壞性影響降至最低。在此培養(yǎng)系統(tǒng)中，通過氣體交換器，細胞或者組織的氣泡能夠直接吸入大量氧氣并排出二氧化碳[14]。另外，由于RCCS培養(yǎng)器有很好的物質(zhì)交換功能，因此細胞能夠在RCCS中以很高的密度生長，細胞組織的生物體培養(yǎng)細胞密度大約為107～1011個細胞/mL；其細胞的培養(yǎng)密度大約為107。所以到目前為止，幾乎所有的生物體細胞組織都已經(jīng)能夠通過RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)進行培養(yǎng)。具體分析，RCCS培養(yǎng)器主要有以下4方面優(yōu)勢：

（1）利用RCCS培養(yǎng)器培養(yǎng)細胞能夠為細胞提供良好理想的環(huán)境，與動態(tài)和靜態(tài)組織培養(yǎng)環(huán)境相比，更加接近體內(nèi)的生長環(huán)境，能夠允許細胞聚焦、三位分化以及生長。

（2）在利用動態(tài)的培養(yǎng)系統(tǒng)時，由于懸浮的作用，細胞組織會與推進器接觸，從而使其受到損傷；在處于靜態(tài)的培養(yǎng)裝置中，二維的環(huán)境可能會改變基因的表達和組織細胞的分化，因此這兩種均不是理想的培養(yǎng)系統(tǒng)。而與這兩種培養(yǎng)系統(tǒng)的功能相比，RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能較為理想。一些細胞或者組織在RCCS培養(yǎng)器中，會因為隨機變化的重力矢量而懸浮，從而使組織在整個培養(yǎng)液中處于自由落下的隨機生長狀態(tài)[15-16]。組織在培養(yǎng)液中自由地落下、翻滾并相互混合，不會受到任何一個細胞生長方向的單個細胞重力矢量的相互影響，因此可以向各個細胞生長方向自由地生長[17]。這是目前RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)所表現(xiàn)出來的不同于其他兩種培養(yǎng)系統(tǒng)的特點和優(yōu)勢，也是這種培養(yǎng)系統(tǒng)能夠成為最為理想的培養(yǎng)裝置的一個重要原因。

（3）在旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，沒有推進器、空氣升液器等外力因素，使得細胞受到的破壞力減至最小。細胞都維持在一個較為適合生長的軌道中，因此能夠共同生長，從而形成一種三維式結(jié)構(gòu)。

（4）旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)是目前世界上唯一一種能使研究者進行共同培養(yǎng)的系統(tǒng)。這種培養(yǎng)方法能夠使高細胞增殖，降低細胞死亡率，并增加細胞的分泌產(chǎn)物。

如表1所示，為旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)與其他培養(yǎng)方式的對比[18]。

5 RCCS的特點

5.1 高分化度

旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)使得高分化的人體組織能夠在實驗室中培養(yǎng)，從而培養(yǎng)出與人體器官相類似的細胞。

5.2 很好地模擬微組織重力

在目前傳統(tǒng)的微重力培養(yǎng)方式中，研發(fā)者一般都需要在體內(nèi)的外部環(huán)境中很好地模擬正常細胞組織生長的過程和環(huán)境。但是由于細胞外的基質(zhì)太復雜，且培養(yǎng)的細胞難以很好地適應其在細胞外的正常生長環(huán)境，所以在正常培養(yǎng)的細胞生長過程中很難獲得成功。但是細胞外的基質(zhì)對于研發(fā)者調(diào)節(jié)細胞骨架和促進細胞核機制蛋白的正常培養(yǎng)可能會起到至關(guān)重要的促進作用，因此RCCS系統(tǒng)可以解決由于分裂而本來應在一起的細胞組織的重力問題，從而能夠很好地模擬體內(nèi)的環(huán)境，改善傳統(tǒng)培養(yǎng)方式的不足[18]。

5.3 三維細胞培養(yǎng)

在普通的三維生物化學反應器中，細胞要長期保持三維細胞的正常懸浮和流動狀態(tài)，導致細胞間極有可能產(chǎn)生剪切力，影響了三維細胞間的穩(wěn)定，使得組織和三維細胞的注意力集中于自身的修復，從而對其生長和發(fā)育產(chǎn)生了很大的影響[13]。發(fā)酵罐主要是用來儲存和培養(yǎng)大量的三維細菌，并不特別適合哺乳動物細胞以及其他動物組織的三維細胞培養(yǎng)。因此，把眾多的三維細胞直接移植至發(fā)酵罐中，只能保證很低的細胞成活率。而旋轉(zhuǎn)式發(fā)酵罐培養(yǎng)系統(tǒng)能夠很好地允許大規(guī)模的細胞生產(chǎn)，細胞平均成活率最低能達到97%，且細胞分化的速度還極高。

6 RCCS的應用

目前，大型旋轉(zhuǎn)式體外組織培養(yǎng)系統(tǒng)已被廣泛應用于臨床生物醫(yī)學等各個領(lǐng)域。這種大型旋轉(zhuǎn)式體外組織培系統(tǒng)不僅可以直接用于人工生成各種大型高仿和逼真的體外體內(nèi)組織培養(yǎng)模型，還可以直接用于人體進行長期的體外組織培養(yǎng)，被廣泛應用的培養(yǎng)場景主要有以下9種[18]。（1）疫苗生產(chǎn)。RCCS培養(yǎng)的肝在歐洲和美國已廣泛地應用于生產(chǎn)，使其可以代替成為人的肝臟成為現(xiàn)實；（2）組織移植。用旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)的某些人體組織已經(jīng)和自然狀態(tài)下的組織在整體上無差別，所以這種培養(yǎng)技術(shù)使得局部組織的移植成為可能。（3）細胞軟骨關(guān)節(jié)再生。經(jīng)RCCS細胞再生系統(tǒng)復制和培養(yǎng)的細胞軟骨密度極高，可有效治療軟骨關(guān)節(jié)損傷。（4）骨髓再生。經(jīng)RCCS培養(yǎng)的骨髓生長狀況極佳，可依靠該方法建立大型骨髓庫，使更多的人受益。（5）分化性皮膚培養(yǎng)移植。經(jīng)過該系統(tǒng)培養(yǎng)的皮膚分化程度極高，彌補了以前的培養(yǎng)系統(tǒng)的一些不足之處，為那些需要及時進行皮膚移植的人們和患者帶來了福音。（6）有效殺滅腫瘤。（7）腫瘤等病癥的理想模型。

表1 各種培養(yǎng)系統(tǒng)的對比

7 結(jié)語

旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)雖然為細胞的培養(yǎng)提供了理想的裝置，但是還存在一些不足之處，如儀器的使用成本較高，使用前的儀器消毒也比傳統(tǒng)的方法復雜。但是，這種培養(yǎng)系統(tǒng)依舊具有很好的發(fā)展前景，值得進行深入研究和廣泛應用，并為人類的發(fā)展以及進步做出貢獻。