枸杞LbAPX基因cDNA片段的克隆及生物信息學分析

郭寧強

（平羅縣第二中學，寧夏石嘴山 753400）

枸杞（LyciumbarbarumL.）屬于茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium），通稱茨圓或紅果子[1]。抗壞血酸過氧化物酶（Aseorbateperoxidase，APX），也叫維生素C過氧化物酶，普遍存在于高等植物、真核藻類和部分藍細菌中，在部分昆蟲中也檢測出APX活性[2]。抗壞血酸過氧化物酶屬于末端氧化酶的一種，在1976年才被Foyer和Halliwell發現[3]。近十幾年來，其重要的生理生化功能受到研究者的廣泛關注。

抗壞血酸過氧化物酶（APX）是一種亞鐵血紅素蛋白[4]，對底物抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）有極高的專一性[5]。AsA是植物體內合成的一類己糖內酯化合物，在植物的生長以及發育中發揮著重要作用，如抗氧化和清除自由基、光合作用和光保護、細胞的生長和分裂以及參與乙烯的合成等[6]。

APX是眾多植物活性氧代謝中非常重要的抗氧化酶之一，不僅是植物葉綠體中清除H2O2的關鍵酶，還是維生素C代謝中主要的酶類。而在植物的光合作用中起到一定的催化作用。經相關研究表明，通過對抗壞血酸過氧化物酶的克隆，可以提高植物的抗逆性和光合作用能力。目前，少見有枸杞抗壞血酸過氧化物酶的相關研究報道，本研究克隆到LbAPX基因cDNA片段，并對其序列進行生物信息學分析，分析結果為進一步研究該基因在枸杞中的功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

枸杞品種“寧杞1號”生長于育新公司試驗基地，自然條件生長，于2015年6—7月采摘花蕾冰盒帶回實驗室。液氮速凍后貯于-80 ℃備用。

1.2 主要試劑

LA-Taq 聚合酶、連接載體 pMD? 19-T Vector，TaKaRa 公司；RNA Plant Extraction Kit DP419，天根公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根公司；PrimeScriptTM1 Strand cDNA Synthesis Kit、SMART PCRcDNA Synthesis Kit，Clontech 公司。

1.3 主要儀器

KYC-1102C型恒溫培養搖床，上海浦東物理光學儀器；高速冷凍離心機，意大利ALC公司；DTC型PCR儀，西安天隆科技有限公司；Gel doc2000型凝膠成像儀，美國BIO-RAD公司；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.4 實驗方法

1.4.1 總RNA提取和純化、cDNA第一鏈的合成

1.4.1.1 總RNA的提取（TRIZOL法）

用北京天根公司（TIANGEN）的RNA Plant Extraction Kit DP419試劑盒對總RNA進行提取。

1.4.1.2 RNA的純化與檢測

為了防止基因組DNA污染，對總RNA樣品進行DNAase I消化和苯酚/氯仿抽提純化。純化后，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳（電泳條件：1×TAE；130 V，15 min），后續對總RNA的質量進行了檢測。若非常明顯看到28S rRNA和18S rRNA的兩條帶，證明其完整性較好。若出現彌散狀或條帶看不清說明總RNA已嚴重降解。

1.4.1.3 cDNA第一鏈合成

參 照 SMART PCRcDNA Synthesis Kit說 明 書 對cDNA第一鏈進行合成。

1.4.2 LbAPX基因cDNA保守區片段的克隆

1.4.2.1 引物設計

根據先前枸杞花藥蛋白質組學的研究中，質譜鑒定的肽段序列信息，進行了數據庫搜索，通過對比番茄、煙草、大豆和棉花等同源基因的氨基酸序列保守區，采用primer5軟件并設計LbAPX引物序列。

上游引物：5'-GGAATATGCAGAGAAGTATGCT GTAGATCAAG-3'。

下游引物：5'-CAAATCTTAAGCTTCCATTAGCT CCACCTC-3'。

1.4.2.2 PCR擴增

PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳、染色以及凝膠成像系統拍照。

1.4.2.3 目的片段的回收

PCR目的片段采用TaKaRa公司的Agrose Gel DNA Extraction Kit回收。

1.4.3 大腸桿菌感受態細胞的制備、連接、轉化及鑒定

1.4.3.1 大腸桿菌感受態細胞的制備

用CaCl2法制備大腸桿菌感受態細胞。

1.4.3.2 目的基因與T載體連接

回收產物 4 μL、SolutionⅠ 5 μL、pMD18-T Vector 1 μL 混合后離心混勻，在 16 ℃恒溫條件下連接 3 h。

1.4.3.3 轉化

連接產物10 μL，DH5α感受態細胞50 μL，二者混勻，冰上放置 30 min；隨后 42 ℃熱激 90 s，冰上放 5 min 后加入 200 μL LB 液體培養基，培養 1 h（110 r/min、37 ℃）；取LB培養液，均勻涂板在LB的固體培養基（100 μg/mL Amp），先正面培養 1 h，再倒置培養 12～16 h（37 ℃恒溫）。

1.4.3.4 鑒定

用1.0%瓊脂糖凝膠來檢測PCR產物，其中陽性克隆的菌液送上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.4.4 LbAPX基因系統進化分析

采用NCBI網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）下載了部分來源于其他植物的APX類蛋白序列信息，經過BioXM2.6軟件進行了同源性比對，用MEGA 4.1軟件對上述植物的APX基因進行了系統發生分析。

2 結果與分析

2.1 RNA完整性檢測

由圖1可以看出，在0.1%的瓊脂糖凝膠上，RNA泳道無背景，28S和18S兩條帶的帶型清晰。經分光光度計測定其A260/A280介于1.8～2.0。表明提取到的枸杞花藥總RNA質量較高，可用于后續的反轉錄研究。

圖1 枸杞花藥RNA電泳圖

2.2 LbAPX基因cDNA保守區序列的獲得及同源性分析

2.2.1 LbAPX基因cDNA保守區序列的獲得

以枸杞花藥cDNA為模板，經RT-PCR得到一條大小約為670 bp的特異片斷，如圖2所示。

對特異片段進行回收，隨后連接和轉化，進行陽性克隆篩選及PCR鑒定，鑒定結果如圖3所示。

圖2 枸杞LbAPX基因PCR

圖3 枸杞LbAPX基因菌液PCR

對菌液進行測序，測序結果序列如表1所示。該序列長670 bp，具有完整的ORF。

2.2.2 LbAPX花藥基因cDNA編碼產物的同源性和系統發生分析

用Blast分析了LbAPX的ORF編碼的氨基酸序列，結果如圖4。其氨基酸保守結構區域位于3～145 AA，證明屬APX超基因家族。該氨基酸序列與馬鈴薯植物葉綠體抗壞血酸過氧化物酶同源性高達96%。

圖4 LbAPX基因氨基酸的保守結構域

采用MEGA4.1軟件對枸杞、馬鈴薯、煙草、棉花和大豆等來自于不同物種的APX進行進化分析，結果如圖5所示。從系統發生分析可看到，LbAPX與煙草和馬鈴薯的APX蛋白進化關系最近，與棉花的親緣關系則相對較遠。

圖5 LbAPX蛋白的進化分析

表1 菌液測序結果

3 討論與結論

APX蛋白是一類酸性、可溶性蛋白，已經發現的蛋白種類約200多種。伴隨克隆技術的發展及APX蛋白的cDNA文庫建立，人們漸漸認識到這是一類任何真核細胞中都普遍存在的蛋白質。研究發現，APX蛋白在植物中的功能主要集中在植物種子的萌發、植物細胞信號轉導、植物營養物質代謝、物質運輸、細胞周期的調控等方面。植物中該蛋白克隆已經有很多報道，尤其在對該蛋白的生理生化功能方面有相關報道。通過克隆技術，在馬鈴薯和番茄以及油菜植物中可調節植物的抗逆性[7-8]。

利用TRIZOL法提取了“寧杞1號”花藥總RNA，采用 SMART PCRcDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA，并設計引物克隆了抗壞血酸過氧化物酶的cDNA片段。通過相關軟件進行了生物信息學分析，得到了長度為670 bp的片段和完整的ORF，該ORF長為456 bp，編碼146個氨基酸。經cDNA編碼產物的同源性和系統發生分析，表明枸杞LbAPX基因屬于APX超基因家族。該氨基酸序列與馬鈴薯的同源性高達96%。實驗結果為進一步深入研究LbAPX編碼的蛋白在枸杞中的相關功能及相應的生理生化性質奠定了前期基礎。