田瑜琳，雒曉芳，朱雅雯，趙梓彤

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，甘肅蘭州 730030）

近年來(lái)，隨著城市化的發(fā)展，水環(huán)境受到很大程度的影響，存在較為嚴(yán)重的水質(zhì)污染等問(wèn)題，城市生態(tài)系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞[1]。這種現(xiàn)象嚴(yán)重威脅了社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展和人類的生活生產(chǎn)。

絮凝是當(dāng)前污水處理過(guò)程中十分重要的方法，可以使水或者污水中的懸浮顆粒碰撞聚集，加快粒子沉降，是一種廣泛運(yùn)用的水處理技術(shù)。常規(guī)絮凝劑通常被分為成三大類，無(wú)機(jī)絮凝劑、人工合成有機(jī)高分子絮凝劑和天然高分子絮凝劑[2]。無(wú)機(jī)絮凝劑和有機(jī)高分子絮凝劑在處理水的過(guò)程中會(huì)給水體帶來(lái)二次污染，天然高分子絮凝劑具有綠色環(huán)保無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，微生物絮凝劑發(fā)展成為一種新興絮凝劑，這是一類由微生物產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外具有絮凝活性的代謝產(chǎn)物構(gòu)成的絮凝劑，一般由多糖、蛋白質(zhì)、DNA、纖維素、糖蛋白、聚氨基酸等高分子物質(zhì)構(gòu)成，分子中含有多種官能團(tuán)，能使水中膠體懸浮物相互凝聚、沉淀[3]。微生物絮凝劑以其安全高效、無(wú)二次污染、來(lái)源范圍廣、生產(chǎn)周期短以及種類多等特點(diǎn)脫穎而出，被廣泛應(yīng)用于城市污水、印刷污水、屠宰廠污水、煤泥廢水等的處理中，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本次試驗(yàn)針對(duì)微生物絮凝劑的產(chǎn)生和絮凝效果進(jìn)行研究，以雒曉芳等[9]在山東臨淄金嶺回族鎮(zhèn)的污水和淤泥中分離篩選出的志賀氏菌ZF-1作為實(shí)驗(yàn)菌株，研究其產(chǎn)生的絮凝劑的絮凝特性，設(shè)計(jì)不同單因素試驗(yàn)測(cè)定絮凝劑的絮凝率，分析不同因素對(duì)絮凝效果的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來(lái)源

實(shí)驗(yàn)所用菌種為雒曉芳等[9]在山東省臨淄區(qū)金嶺回族鎮(zhèn)的水渠中分離得到的有絮凝活性的菌株，經(jīng)生理生化試驗(yàn)鑒定為志賀氏菌屬（Shigella Castellani），并命名為ZF-1，產(chǎn)生的絮凝劑命名為ZF-1C。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸出粉3.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L，pH 7.2±0.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌 30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5 g/L KCl，2.0 g/L NaNO3，0.01 g/L Fe2SO4，1.0 g/L K2HPO4，0.5 g/LMgSO4，30.0 g/L 蔗糖，121 ℃高壓蒸氣滅菌 30 min，pH 自然。

其他試劑：高嶺土、FeCl3、無(wú)水CaCl2，所有試劑均為化學(xué)純，由杭州微生物有限責(zé)任公司提供。

儀器：YXQ-LS-立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHG-9140A新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，寧波江南儀器廠；干燥箱，寧波江南儀器廠；LRH-150B生化培養(yǎng)箱，ZWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；G10SUV-VIS雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，Thermo Fisher Scientific有限公司；S.SW-CJ-2F凈化工作臺(tái)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；BA210生物顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

采用李靜[10]試驗(yàn)中的比濁法，在660 nm處測(cè)定發(fā)酵液的濁度（OD660），用所得數(shù)據(jù)表示絮凝菌株的生長(zhǎng)狀況，生成的曲線圖即可表示絮凝菌的生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 絮凝率的測(cè)定

參考姜宇等[11]的絮凝活性測(cè)定方法，進(jìn)行絮凝活性的測(cè)定。

1.2.3 絮凝活性的分布

在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取一環(huán)提前復(fù)壯的ZF-1菌株，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，將菌液置于震蕩培養(yǎng)箱中于 160 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng) 24 h 得到種子培養(yǎng)液。取30 mL種子培養(yǎng)液加入到裝有250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，180 r/min、30 ℃震蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)完成的發(fā)酵液 4 000 r/min 離心 30 min，所得上清液用于研究產(chǎn)絮凝劑菌株的相關(guān)絮凝活性，將沉淀用蒸餾水洗滌兩次后加入等體積的蒸餾水吹打混勻得到菌細(xì)胞懸液。依照1.2.2的方法，測(cè)定發(fā)酵液、離心上清液和菌細(xì)胞懸液的絮凝率，并比較結(jié)果。

1.2.4 絮凝劑的制備

微生物絮凝劑產(chǎn)生菌ZF-1發(fā)酵液離心后得到上清液中加入二倍體積的遇冷處理過(guò)的己醇，將其混合均勻后在4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜，上清發(fā)酵液經(jīng)過(guò)低溫下反復(fù)的醇提，得到微生物絮凝劑ZF-1C。

1.2.5 絮凝條件的工藝優(yōu)化

微生物絮凝劑的絮凝效果除受絮凝劑本身的相對(duì)分子量、分子結(jié)構(gòu)影響外，還受絮凝劑的投加量和反應(yīng)體系的溫度、pH值、金屬離子等影響。故設(shè)計(jì)多項(xiàng)單因素試驗(yàn)，探究絮凝劑最佳絮凝條件，對(duì)其進(jìn)行工藝優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZF-1培養(yǎng)特征

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為及時(shí)了解菌種在培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)情況，需定時(shí)測(cè)定菌體OD660指標(biāo)及絮凝效果，以便適時(shí)控制培養(yǎng)條件，從而獲得最佳培養(yǎng)物[12]。

由圖1可知，ZF-1菌株在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)到2 d時(shí)達(dá)到最高，之后生長(zhǎng)曲線開(kāi)始緩慢下降，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物消耗和代謝物的增加。絮凝率也在第2 d大幅增高，之后增加平緩，因此選取2 d作為發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間，以節(jié)約成本。菌種的絮凝率和生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)一致，在ZF-1生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)產(chǎn)生絮凝活性物質(zhì)。說(shuō)明絮凝劑的積累伴隨著菌體的生長(zhǎng)而增長(zhǎng)，產(chǎn)絮主要出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在穩(wěn)定期持續(xù)產(chǎn)生絮凝活性物質(zhì)[13]。

圖1 ZF-1菌生長(zhǎng)曲線及絮凝活性變化曲線

2.2 絮凝活性分布實(shí)驗(yàn)

通過(guò)對(duì)發(fā)酵液、發(fā)酵上清液以及菌細(xì)胞懸液進(jìn)行高嶺土懸濁液的絮凝活性測(cè)定，可以知道絮凝劑是菌體本身還是代謝產(chǎn)物。測(cè)定結(jié)果為圖2，分析ZF-1所產(chǎn)絮凝劑分布情況。

由圖2可知，發(fā)酵后的培養(yǎng)液和發(fā)酵后去菌細(xì)胞的上凊液絮凝率分別為58.5%和68.81%，菌細(xì)胞懸液的絮凝率為3.99%。試驗(yàn)結(jié)果表明，ZF-1所產(chǎn)生的微生物絮凝劑是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌產(chǎn)生的，并不是細(xì)菌本身。為進(jìn)一步提取絮凝劑和實(shí)際應(yīng)用提供了可信的依據(jù)[14]。根據(jù)以上數(shù)據(jù)分析，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用的微生物絮凝劑ZF-1C是從離心上清液中通過(guò)低溫下反復(fù)醇提獲取的。

圖2 絮凝活性分布

2.3 絮凝劑的熱穩(wěn)定性研究

將微生物絮凝劑在100 ℃水浴中加熱15 min、30 min、45 min、60 min、75 min 后分別測(cè)定加熱后的絮凝活性，測(cè)定結(jié)果為圖3。

由圖3可知，ZF-1C有良好的熱穩(wěn)定性，在100 ℃加熱60 min的情況下，絮凝率變化幅度小于20%，在加熱至75 min時(shí)下降了23.38%。以蛋白質(zhì)為主要成分的微生物絮凝劑活性受溫度影響較大，耐熱性較差；多糖構(gòu)成的微生物絮凝劑則不受溫度的影響，耐熱性好；若為糖蛋白則取決于糖和蛋白質(zhì)的含量[15]。而ZF-1C在100 ℃加熱60 min絮凝活性變化不大，所以判定該絮凝劑是具有熱穩(wěn)定性的多糖。

圖3 100 ℃下加熱時(shí)間對(duì)絮凝效果的影響

2.4 絮凝體系pH對(duì)絮凝效果的影響

用1% NaOH溶液或1% HCl調(diào)節(jié)絮凝體系的pH。測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 絮凝體系pH值對(duì)絮凝效果的影響

pH值能通過(guò)改變酸堿度來(lái)改變絮凝劑大分子和膠體顆粒的表面電荷、帶電狀態(tài)、中和電荷能力，從而改變顆粒之間的相互作用力，對(duì)架橋的形成產(chǎn)生影響[16]。由圖4可知，在pH為3和7時(shí)，絮凝率達(dá)到60%以上，這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，給絮凝劑與懸浮顆粒之間提供了創(chuàng)造架橋氫鍵的氫離子，絮凝劑大分子通過(guò)氫鍵與多個(gè)膠體顆粒結(jié)合，形成較大的顆粒團(tuán)塊沉淀下來(lái)[17]。在實(shí)際運(yùn)用中，酸性環(huán)境會(huì)對(duì)水體造成二次污染且經(jīng)濟(jì)成本較高，故pH為7可達(dá)到最佳絮凝效果。

2.5 絮凝劑投加量對(duì)絮凝效果的影響

由圖5可知，促進(jìn)絮凝的最佳絮凝劑添加量為4 mL/L。絮凝劑投加量增加至5 mL/L時(shí)絮凝活性降低，這是因?yàn)檫^(guò)多帶負(fù)電的絮凝劑存在，使高凝土懸著液顆粒間的靜電斥力和競(jìng)爭(zhēng)吸附力加強(qiáng)，反而不利于絮凝體系的穩(wěn)定和沉淀[18]。

圖5 絮凝劑投加量對(duì)絮凝效果的影響

2.6 金屬離子對(duì)絮凝效果的影響

金屬離子能促進(jìn)高嶺土懸浮液中顆粒的聚集沉降。由圖6可知，KCl、NaCl和FeCl3助凝效果較差；FeSO4具有較好的助凝作用；CaCl2助凝效果最好，并且作為助凝劑添加到絮凝體系中不會(huì)帶來(lái)二次污染。

圖6 無(wú)機(jī)金屬離子對(duì)絮凝效果的影響

一般認(rèn)為，一價(jià)的金屬陽(yáng)離子因只能和懸浮顆?；蛘呶⑸镄跄齽┲械囊粋€(gè)發(fā)生鍵合，所以不能連接懸浮顆粒與微生物絮凝劑；三價(jià)的金屬陽(yáng)離子由于其離子強(qiáng)度高，會(huì)過(guò)多占據(jù)微生物絮凝劑的活性位點(diǎn)，不利于微生物與懸浮顆粒結(jié)合，二價(jià)金屬陽(yáng)離子剛好在絮凝劑分子與懸浮顆粒間以離子鍵結(jié)合，可以促進(jìn)絮凝[19]。所以二價(jià)的鈣離子和鐵離子絮凝率相對(duì)較高，其中鈣離子是最佳的助凝劑。

2.7 鈣離子濃度對(duì)絮凝效果的影響

由圖7可知，添加不同濃度的鈣離子對(duì)絮凝體系的助凝效果不同，在鈣離子濃度較低的時(shí)候，隨鈣離子濃度增加，絮凝率逐漸增高。當(dāng)鈣離子濃度達(dá)到7 mmol/L 時(shí)，絮凝率最高達(dá)到 68.97%；超過(guò) 7 mmol/L后，絮凝率開(kāi)始降低。多價(jià)金屬離子可以與膠體顆粒相結(jié)合后中和負(fù)電荷，使膠體減少靜電斥力，更易形成絮體，然后在微生物絮凝劑的作用下形成更大的絮團(tuán)，但過(guò)量的金屬離子會(huì)占據(jù)微生物絮凝劑的活性位點(diǎn)，反而抑制了絮凝效果[20]。

圖7 Ca2+濃度對(duì)絮凝效果的影響

3 結(jié)論

用具有絮凝活性的志賀氏菌ZF-1培養(yǎng)產(chǎn)生的絮凝劑ZF-1C進(jìn)行絮凝特性的研究，改變反應(yīng)體系pH值、ZF-1C投加量、金屬離子的種類、CaCl2濃度均會(huì)影響絮凝劑的絮凝效果，得出最佳pH值為7、ZF-1最佳投加量為4 ml/L、CaCl2最佳濃度為 7 mmol/L。在實(shí)際運(yùn)用中，絮凝劑投加在污水中時(shí)需要考慮絮凝劑的反應(yīng)體系環(huán)境，才能發(fā)揮絮凝劑的最佳絮凝效果。