甘藍夜蛾核型多角體病毒DNA解旋酶2的原核表達研究

楊杰，徐聞，孫項，周吟

（湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430068）

農業(yè)昆蟲取食農作物，往往會造成較大經濟損失，目前用得較多的是化學農藥。但化學農藥的使用對環(huán)境有危害，對人也有毒性。桿狀病毒可以作為生物農藥使用，但是殺蟲譜比較窄。傳統(tǒng)觀點認為，一種昆蟲桿狀病毒只能防控一種害蟲。農作物常常被多種害蟲取食，導致普通的昆蟲病毒因為殺蟲譜較窄，限制了實際應用。甘藍夜蛾核型多角體病毒（MbMNPV）是一種廣譜性昆蟲病毒，能殺滅32種鱗翅目害蟲，其中包括有甘藍夜蛾、甜菜夜蛾、棉鈴蟲、小菜蛾、小地老虎、黃地老虎、粘蟲、稻縱卷葉螟和豆野螟等多種農業(yè)重要抗性害蟲[1]。

截止目前，桿狀病毒中多個基因被認為和病毒的宿主域相關，如已有p35、病毒DNA解旋酶p143、lef7和ie-2等[2]，其中DNA解旋酶p143基因不僅參與了DNA復制，也是最早被發(fā)現(xiàn)的與病毒宿主域相關的基因。不同桿狀病毒的宿主域并不相同，如苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（AcMNPV）可以感染超過40種昆蟲種類，而家蠶核型多角體病毒（BmNPV）只能感染家蠶這1種宿主，當AcMNPV中p143發(fā)生突變以后，就具有感染家蠶的能力[3]。

在MbMNPV的基因組中，除了存在解旋酶基因以外，還存在第2個拷貝的“截短版”DNA解旋酶基因（helicase 2，簡稱為hel-2），hel-2基因只在6種核型多角體病毒（NPV）中存在，但是幾乎在所有顆粒體病毒（GV）中都存在，兩個DNA解旋酶基因可能有共同的祖先，但hel-2基因序列更加保守[4]。

為了確定hel-2基因是否與病毒的宿主域相關，可以對該蛋白進行原核表達并純化后，檢測其能否對不具有廣譜殺蟲活性的NPV起到擴大殺蟲譜的作用。本文克隆了甘藍夜蛾核型多角體病毒hel-2基因，并在大腸桿菌中進行了原核蛋白表達。

1 材料與方法

1.1 材料

MbMNPV由中國科學院武漢病毒研究所張忠信研究員惠贈。大腸桿菌DH5a和BL21菌種來自本實驗室保存。DNA polymerase購自北京擎科新業(yè)生物技術有限公司，限制性內切酶NotI和XhoI，T4 DNA連接酶購自 TAKARA 公司，DL2000 DNA Ladder、DL5000 DNA Ladder蛋白質 Marker、ECL Plus超敏發(fā)光液、小鼠抗His-tag抗體、HRP標記山羊抗小鼠二抗購自北京索萊寶科技有限公司，質粒抽提試劑盒（Plasmid Mini Kit I）和膠回收純化試劑盒（Gel Extraction Kit）購自 Omega Bio-tek 公司。

1.2 方法

1.2.1 設計引物

通過堿裂解法抽提甘藍夜蛾核型多角體病毒的基因組DNA[5]，以該總DNA為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中MbMNPV中helicase 2的DNA序列設計hel-2引物：上游引物為5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCA TGAAGCGCACTAGTGTC-3'，下游引物為5'-CCG CTCGAGTTATAACACAAGGTTGGG-3'，進行甘藍夜蛾核型多角體病毒hel-2基因的PCR擴增。

1.2.2 表達載體的質粒構建和鑒定

將pET28a和上述hel-2的PCR產物分別經NotI/XhoI雙酶切，再用膠回收試劑盒進行切膠回收，按照其說明書步驟進行，將hel-2和pET28a膠回收產物在4 ℃進行過夜酶連，轉化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5，經過卡那霉素平板篩選得到陽性轉化子。挑取單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中，使用質粒抽提試劑盒提取質粒，并使用NotI和XhoI進行雙酶切，并進行瓊脂糖電泳檢測驗證。

1.2.3 蛋白的誘導表達和蛋白質免疫印跡鑒定

將構建成功的載體轉化到感受態(tài)細胞大腸桿菌BL21，挑取單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中活化過夜，再將菌液以1∶100的濃度接種到10 mL液體LB中，37 ℃培養(yǎng)3 h，再加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至不同終濃度（1 mg/mL），摸索誘導條件，超聲破碎細菌，分別收集上清與沉淀，進行SDSPAGE檢測，并使用His-Tag抗體，進行免疫印跡檢測。

2 結果與分析

2.1 pET28a-hel2原核表達載體構建

首先提取MbMNPV的基因組DNA，再以該基因組DNA為模板，使用sense和antisense引物擴增helicase 2基因，PCR產物進行DNA電泳檢測，結果如圖 1 所示，helicase 2 基因的長度為 1 368 bp，產物大小與預期一致。

圖1 hel-2基因PCR擴增產物

對該PCR產物和pET28a載體分別用NotI/XhoI進行雙酶切，對酶切后的產物DNA凝膠電泳和切膠回收后，進行酶連轉化，對轉化平板上的單菌落抽提質粒，使用NotI/XhoI進行雙酶切驗證。結果如圖2所示，載體片段大小和外源目的片段大小（1 368 bp）與預期一致，表明hel-2基因片段已經連入表達載體pET-28a，將酶連產物送到測序公司進行測序驗證，結果顯示序列正確無誤。

圖2 重組質粒pET28a-hel2質粒酶切電泳圖譜

2.2 Hel-2蛋白誘導條件摸索

在誘導溫度37 ℃、0.4 mmol/L的IPTG濃度下，檢測了不同誘導時間對Hel-2蛋白表達的影響，收集IPTG誘導不同時間的BL21菌體，超聲破碎菌體后分別收集沉淀與上清，使用SDS-PAGE檢測，結果如圖3所示。誘導后1 h開始，可以在沉淀中檢測到目的蛋白表達，與預期大小一致，隨著誘導時間的增加，還是只能在沉淀中檢測到目的蛋白表達，而上清液中沒有檢測到目的蛋白表達。

圖3 不同誘導時間下Hel-2蛋白表達的SDS-PAGE圖譜

為了增加蛋白的可溶性表達，決定嘗試低溫誘導的方式，誘導溫度18 ℃，誘導時間為16 h，在不同IPTG濃度下進行誘導，收集不同IPTG誘導濃度的菌體，超聲破碎菌體后分別收集沉淀與上清，使用SDSPAGE檢測，結果如圖4所示。低溫誘導的Hel-2蛋白還是只在沉淀里表達，在上清里面沒有檢測到目的蛋白，但與37 ℃誘導條件相比，沉淀中的目的蛋白生成總量有所降低。

圖4 不同IPTG濃度下Hel-2蛋白表達的SDS-PAGE圖譜

2.3 Hel-2蛋白的免疫印跡驗證

在多種誘導條件下，Hel-2蛋白都以沉淀形式表達，在上清中沒有檢測到可溶性表達的蛋白，Hel-2蛋白帶有His-tag標簽，所以采用His-tag抗體檢測了 37 ℃、0.4 mmol/L IPTG 誘導條件下，Hel-2 融合表達蛋白的表達情況，結果如圖5所示。上清中沒有任何信號，沉淀中能在約58 kDa處有Hel-2蛋白的表達，此外還有2個非特異性條帶。該結果進一步驗證了SDS-PAGE的結果，Hel-2蛋白全部以包涵體的形式表達，上清中并無可溶性表達產物。

圖5 Hel-2蛋白的免疫印跡結果

3 結論

將甘藍夜蛾核型多角體病毒的解旋酶2進行原核表達，結果顯示該蛋白在大腸桿菌中以包涵體的形式表達，上清液中沒有檢測到可溶性表達蛋白，這可能是解旋酶2與DNA復制過程相關，表達產物對細菌有毒性，因此以包涵體形式表達。未來可以通過在真核細胞內將該蛋白表達，并進一步探究該蛋白是否影響了病毒的廣譜殺蟲功能。