蘇鵬濤，楊勸生，趙強，王順才，汪霞平

（1.金昌市人民醫院，甘肅金昌 737100；2.甘肅工業職業技術學院，甘肅天水741025；3.天水師范學院，甘肅天水741001；4.甘肅天水岐黃藥業有限責任公司，甘肅天水 741018）

紅茂草富含揮發油、生物堿、黃酮等多種成分， 味苦、澀，性涼，有清熱解毒、抗菌消炎、消腫止痛等功效[1-2]。用于治療動物各類創傷性炎癥和開放性淋巴結核、羊傳染性膿皰病、家兔皮膚毛囊炎、動物皮膚疥癬病等癥。本研究采用代謝組學方法，考察紅茂草揮發油足腫脹大鼠血漿內源性代謝物的變化，為該藥物的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

超高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜（UPLC-Q/TOF-MS），美國Aglient公司；CPA225D型電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；渦旋振蕩器，德國IKA公司；5920R型冷凍告訴離心機，德國Eddendorf公司；KMD型調溫電熱套，山東永興儀器廠；迷你勻質機，加拿大ATS公司；揮發油提取裝置，天津市天玻玻璃儀器有限公司。

乙腈、甲醇，色譜純，Baker公司；甲酸，分析純，Signia公司；地塞米松磷酸鈉注射液（Dex），2 mg/mL，批號1901403，山西晉新雙鶴藥業有限責任公司；叉菜膠I型，25 g，批號C1013，Sigma公司產品，臨用前用新鮮的生理鹽水配制。

1.2 試驗材料及預處理

Wistar大鼠，購于甘肅中醫藥大學實驗動物中心，取體重200 g±20 g健康大鼠置于光照和黑暗環境（溫度22 ℃±5 ℃、濕度50%±5%）下飼養；紅茂草揮發油，采用CO2超臨界萃取法制備[3]。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物分組

80只Wistar大鼠每天自由飲食飲水各12 h，適應7 d，隨機分為空白對照（C）、陰性對照（NC）、給藥試驗（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）、地塞米松陽性對照（Dex）8組，每組10只，均在左后足踝關節處標記。

1.3.2 造模

空白對照和陰性對照：每日1次灌胃生理鹽水（2.0 mL/kg），正常飼養，連續灌胃7 d；給藥試驗：每日1次分別灌胃紅毛草揮發油（2.0 mL/kg、1.5 mL/kg、1.0 mL/kg、0.5 mL/kg、0.2 mL/kg）7 d，飼養同上；地塞米松陽性對照：同空白對照組灌胃及飼養6 d，第7 d時腹腔注射地塞米松（40 μg/kg）。所有大鼠在第7 d給藥后30 min，在右后足跖部皮下注射1%角叉菜膠溶液 0.1 mL 造模[4]。

1.3.3 血漿采集與預處理

用10%的水合氯醛溶液麻醉致炎8 h后的大鼠，采集后右足動脈血，置于盛有EDTA-K2試管中，在40 ℃條件下離心（3 000 r/min）10 min，上清液渦旋震蕩 5 s，取 100 μL 血漿樣品 8 份，分別加入 300 μL甲醇渦旋震蕩30 s，4 ℃條件靜置及離心，上清液于4 ℃存儲。

1.3.4 色譜條件

C18色譜柱 Phnomenx（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相組成：A為水-0.1%甲酸，B為乙腈-0.1%甲酸；柱溫 40 ℃，進樣器溫度 4 ℃，流速 0.8 mL/min，進樣量 10 μL。

1.3.5 數據分析

利用自動進樣系統采集數據、提取對齊UPLC-Q/TOF-MS原始數據，通過XCMS軟件進行峰提取、去噪、匹配、對齊以及數據的導出和保存。經歸一化處理和修正的Excel文件導入SIMCA-P 11.5和SPSS 22.0軟件，結合偏最小二乘法選出P＜0.05的生物性標志物。

1.3.6 鑒定差異代謝物

根據保留時間（tR）和變量重要因子（VIP）質譜信息結合京都基因與基因組百科全書（KEGG）等數據庫檢索，分辨代謝物MS譜，確定差異代謝物及含量變化。

2 結果與分析

2.1 不同劑量紅茂草揮發油對大鼠足腫脹的影響

分別造模后于 1 h、2 h、3 h、5 h 和 8 h 測定致腫脹的足容積，計算各大鼠致右后足跖腫脹前后容積變化值，以足腫脹度和足腫脹抑制百分率表示藥物的抗炎效果，結果如表1所示。結果表明，與對照組比較，給藥試驗組組均有顯著的抑制大鼠角叉菜膠性足腫脹的作用（P＜0.05）。

2.2 差異代謝產物

2.2.1 建立血漿樣本代謝物分析多變量數據

采用UPLC-Q/TOF-MS對血漿樣本分析紅毛草揮發油干預角叉菜膠致大鼠足腫脹的效果，在正負離子模式下分析見圖1和圖2。可以看出在正負離子模式下，8組血漿樣本中空白組、陰性對照組、試驗組及地塞米松陽性組相互分離明顯，試驗組中紅茂草揮發油劑量的增加呈現向空白組和地塞米松陽性對照組靠近的趨勢，說明給予不同量的紅茂草揮發油，均對炎癥大鼠異常的生理及物質代謝有明顯的調節作用，且劑量越大效果越明顯。

表1 各組大鼠不同時點抗角叉菜膠所致足腫脹度比較

圖1 正離子模式下8組大鼠的血漿分析結果

圖2 負離子模式下8組大鼠的血漿分析結果

2.2.2 鑒定差異代謝產物

根據保留時間（tR）和變量重要因子（VIP）質譜信息，通過篩選、查詢，并與京都基因與基因組百科全書（KEGG）等數據庫比較，鑒定出在正負離子模式下血漿樣品中12個潛在的差異代謝物，結果見表2所示。

表2 血漿中差異代謝物序號

可見，血漿樣品中分離出12個潛在的差異代謝物，與空白對照組比較，正離子模式下陰性對照組大鼠血漿中芳樟醇、小茴香醇、3,5-二乙基甲苯、香葉醇、橙花醇和3,5-二乙基甲苯含量明顯高于空白組（P＜0.05）；負離子模式下陰性對照組大鼠血漿中1,3-二甲基萘、1-十六碳烯-1-醇乙酸乙酯、3,4-二甲基-3-環己烯-1-甲醛、壬酸、2-乙烯基萘和肉桂醛含量明顯低于空白組（P＜0.05）。試驗組中的這些標志物含量均向空白組和地塞米松陽性對照組回歸，說明給予不同量的紅茂草揮發油均對角叉菜膠致足炎癥大鼠異常的生理及物質代謝有明顯的調節作用。

3 結論

通過代謝組學方法研究紅茂草揮發油抗大鼠足腫脹炎癥作用機制，顯示不同劑量的紅茂草揮發油均可抑制大鼠角叉菜膠性足腫脹，調節炎癥大鼠異常的生理及物質代謝，劑量越大作用效果越明顯。以血漿樣本分析尋找出內源性代謝產物，比較藥物作用于模型大鼠靶器官或組織前后內源性小分子代謝物（數量、種類）的變化，篩選比對鑒定出12種差異代謝物。研究表明，紅茂草揮發油主要是通過調節血漿物質的代謝發揮抗炎作用，揭示藥物與機體間的相互作用機制，為新藥研發提供參考。