超濾滲濾過程中不溶性顆粒產生的控制研究

羅映，賀蕓芬，劉建平

（1.上海奧浦邁生物科技有限公司，上海201318；2.上海復旦大學生命科學學院，上海200433）

下游蛋白純化工藝平臺主要包括發酵液澄清收獲（離心或深層過濾）、親和層析捕獲過程、低pH病毒滅活孵育與中和、中間品深層過濾、陰離子層析、陽離子層析、納濾除病毒、超濾滲濾和輔料添加等步驟[1]。超濾是利用切向流技術將目標蛋白質濃縮至目標濃度并將溶液進行置換。單克隆抗體分子量一般在150 KD左右，為了截留蛋白，通常選擇小于目標蛋白三分之一分子量大小的膜包進行換液，所以30KD膜包在單克隆超濾滲濾中非常常用。使用超濾膜包將小分子鹽透過，而目標蛋白不斷地循環，將超濾緩沖液連續地加入到樣品流罐，持續攪拌混合，從而達到換液目的[2]。

蛋白質具有復雜的分子結構，由一系列氨基酸組成，并通過折疊形成高級結構。蛋白質復雜的結構使蛋白質較易形成二聚體、多聚體，甚至不溶性顆粒[3]。盡管這些不溶性顆粒一般含量不多，幾乎不會使蛋白藥物的活性受到影響，但也有許多報道稱，蛋白質聚合物和不溶性顆粒會引起免疫應答[4]。因此，在蛋白純化工藝開發和制劑緩沖液及輔料篩選開發工作過程中，都會對不溶性顆粒進行觀察與監測，避免不溶性顆粒的產生。聚集體是單抗類藥物生產過程中一種常見現象，但是目前對聚集體形成的機制還不是很清楚。聚集體最初以二聚體或者蛋白片段的形式存在，隨著熱力學的趨向性，則會偏向于形成亞可見或可見的不溶性顆粒。另外，單抗分子在形成高級結構時，不能完全折疊或者只是部分折疊，暴露的疏水區域之間的疏水作用力也會導致聚集體的形成，甚至形成蛋白沉淀。蛋白異質性也是形成聚集體的一個因素，異質性高的蛋白之間更容易產生共價或非共價的相互作用，從而導致聚集體的產生。一般來說，在蛋白純化的其他步驟中，使用除菌濾器可以去除不溶性顆粒；而超濾操作時，樣品罐中的樣品處于循環狀態，通常這個超濾滲濾操作需4 h以上，過程中可使用攪拌子攪拌來保證樣品儲罐中的蛋白樣品處于均一狀態，蛋白在這個過程中會受到攪拌產生的剪切力等，從而影響蛋白的穩定[5]。目前工藝下，攪拌30 min后，便形成大量不溶性顆粒，膜包堵塞，透過端濾速不斷降低。

因此，通過比較不同緩沖液體系換液、不同添加劑、過程中是否攪拌等因素，查找出不溶性顆粒產生的原因，并找到控制方法，使超濾滲濾得以順利進行。

1 材料與方法

1.1 樣品

CHO（中國倉鼠卵巢細胞）細胞培養液經澄清收獲、親和層析、陰離子層析、陽離子層析純化后得到樣品，蛋白濃度為8.7 g/L。

1.2 主要試劑及儀器

氨丁三醇、冰醋酸、三水醋酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、一水合磷酸二氫鈉、L-精氨酸鹽酸、一水合檸檬酸、檸檬酸鈉、吐溫80均購于J.T.Baker；海藻糖購于Pfanstiehl。所有藥品均符合美國藥典級。

超濾滲濾膜包（孔徑30KD，聚醚砜材質，膜面積50 cm2，貨號 PXB030A05）、壓力表購于默克密理博公司；蠕動泵（Langer BT300-2J）購于蘭格公司。

1.3 實驗方法

實驗采用切向流技術進行超濾滲濾，使用硅膠管道將超濾膜包、壓力監測裝置、泵等進行連接，具體見圖1。將樣品放入樣品罐中，通過進樣泵將樣品進行循環，大于膜包孔徑的蛋白樣品將回流至樣品罐中，小于30KD的小分子鹽等物質透過超濾膜，同時滲濾緩沖液不斷流加至樣品罐中，保持流加速度與透過速度一致，樣品罐中蛋白濃度便會保持不變，樣品罐不斷進行攪拌以保證樣品均一的狀態。研究中的最終處方蛋白濃度為10～12g/L，緩沖液成分為20 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、10 g/L精氨酸、300 g/L海藻糖、0.02%吐溫20，pH為6.0。在UF/DF開發過程中，考慮到海藻糖價格較高，使用不含海藻糖和吐溫的緩沖液作為換液緩沖液，以下簡稱磷酸鹽-精氨酸體系。不同實驗中濃縮后的蛋白終濃度均為15g/L左右，在此濃度下進行換液操作。換液過程中每隔一個換液倍數記錄透過端流速，將換液倍數作為橫坐標，透過端流速作為縱坐標作圖。

圖1 超濾滲濾裝置圖

2 結果與分析

2.1 醋酸體系置換至磷酸鹽-精氨酸體系

在超濾滲濾前樣品經過陽離子層析進行純化，在工藝開發初期，采用的緩沖液為50 mmol/L醋酸鈉、155 mmol/L氯化鈉，pH 5.0。實驗中超濾膜包蛋白載量為150 g/m2。將蛋白從50 mmol/L醋酸鈉、155 mmol/L 氯化鈉、pH 5.0 中換液至 20 mmol/L 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、10 g/L精氨酸，pH 6.0。如圖2所示，從醋酸體系置換至磷酸鹽-精氨酸體系時，整個過程透過端流速降低非常快，膜包嚴重堵塞，整個過程觀察到較多不溶性顆粒。因此，推測不溶性顆粒產生原因可能為緩沖液體系更換，使蛋白不穩定。除醋酸體系外，檸檬酸體系也是純化中常用緩沖液。因此，在實驗中嘗試檸檬酸體系。

圖2 醋酸體系置換磷酸鹽-精氨酸透過端流速衰減圖

2.2 檸檬酸體系置換至磷酸鹽-精氨酸體系

將陽離子層析洗脫液更換為20 mmol/L檸檬酸鈉、160 mmol/L 氯化鈉，pH 5.0，從 20 mmol/L 檸檬酸鈉、160 mmol/L 氯化鈉，pH 5.0 換液至 20 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、10 g/L精氨酸，pH 6.0。因蛋白量較少，實驗中膜包蛋白載量為50 g/m2，此實驗中樣品罐為50 mL離心管，超濾過程中使用手動搖勻。本實驗以2.1為對照，更換了緩沖液體系同時未使用攪拌。如圖3所示，透過端流速未衰減，且無不溶性顆粒，初步確認為磷酸體系與醋酸體系之間的置換或攪拌使蛋白形成了不溶性顆粒。

圖3 檸檬酸體系置換磷酸鹽-精氨酸透過端流速衰減圖

2.3 提高膜包載量

在實驗2.2的基礎上，將膜包蛋白載量增加了12倍，載量為 600 g/m2，實驗樣品罐為 500 mL 康寧瓶，超濾滲濾過程中使用攪拌使樣品保持均一狀態。從圖4可知，整個過程透過端流速衰減較大，且觀察到較多不溶性顆粒。因此，從檸檬酸體系換液至磷酸鹽-精氨酸仍會產生不溶性顆粒。推測引起不溶性顆粒產生的因素為攪拌，在接下來的實驗中進行驗證。

圖4 檸檬酸體系置換磷酸鹽-精氨酸（提高膜載量）透過端流速衰減圖

2.4 精氨酸含量及pH影響

通過陽離子洗脫條件比較，將陽離子層析洗脫緩沖液更換為20 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、90 mmol/L精氨酸鹽酸，pH 6.0，在同一緩沖液體系中進行超濾滲濾，兩種緩沖液僅精氨酸含量及pH不一樣，實驗中超濾膜包的蛋白載量為320 g/m2，整個過程使用攪拌將樣品罐中的蛋白保持均一狀態。從圖5可知，即使在同一體系中進行緩沖液置換，仍有不溶性顆粒產生，整個過程透過端流速降低。

圖5 同種緩沖液置換透過端流速衰減圖

由2.1～2.4的4個實驗可知，導致不溶性顆粒產生的主要因素為攪拌。因此在不同緩沖液中進行攪拌實驗證實攪拌為不溶性顆粒產生的主要原因。

2.5 不同緩沖液體系及添加劑對攪拌的影響

有文獻指出，吐溫可控制不溶性顆粒的產生[6]，并通過實驗考察了磷酸鹽體系、檸檬酸體系中攪拌對不溶性顆粒產生的影響；同時考察了添加吐溫、海藻糖對不溶性顆粒產生的影響。各取0.05 L蛋白樣品，使用攪拌子進行攪拌。觀察攪拌30 min后的表現。加入吐溫后的蛋白樣品攪拌30 min后仍無不溶性顆粒產生。說明吐溫20可以控制不溶性顆粒的產生。接下來的實驗中將少量吐溫20添加至UF/DF樣品中，溶解后再進行UF/DF。

取部分蛋白，初始緩沖液為20 mmol/L檸檬酸鈉、160 mmol/L氯化鈉，pH5.0，濃縮至目標濃度后再進行換液，換液至20 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、10 g/L精氨酸，pH6.0中，因吐溫含量太高時易產生膠束，因此實驗中控制最終吐溫20的濃度為0.01%。加入吐溫后，進行UF/DF過程。從圖2可以看出，整個過程透過端流速降低較少，無不溶性顆粒產生。

圖6 添加吐溫后透過端流速衰減圖

3 結論

以控制UF/DF過程中不溶性顆粒的產生為目的，對UF/DF過程中產生不溶性顆粒的原因進行了考察。比較了不同緩沖液體系間換液過程，發現即使同種緩沖液體系間進行操作仍會產生不溶性顆粒，在其中一個低載量的實驗中未進行攪拌，未發現不溶性顆粒產生，從而找到了產生不溶性顆粒的原因是攪拌。通過查閱文獻，發現吐溫可控制不溶性顆粒的產生。吐溫作為單抗處方中常用的輔料，通常在UF/DF后加入，本研究創新性地將吐溫在UF/DF前加入，控制了不溶性顆粒的產生，使UF/DF工藝可行。